SFTPB、TACSTD1、PVA基因聯合檢測非小細胞肺癌淋巴結微轉移的研究

陳文學 方選妹 黎文婷 齊淑軼 鄒學森

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占80%。肺癌的轉移和復發是患者高死亡率的主要原因，而淋巴結轉移是NSCLC轉移的主要途徑。腫瘤相關鈣信號轉導蛋白1(tumor-associated calcium signal transducer 1，TACSTD1)也稱為上皮細胞粘附分子，在上皮癌變過程中發揮著作用，同時也被用于檢測各種腫瘤的微轉移［1-2］。尋常型天皰瘡抗原(pemphigus vulgarisantigen，PVA)又稱為橋粒芯糖蛋白3，是自身免疫性疾病天皰瘡的血清學抗原，在頭頸腫瘤中研究較多，近年來有報道其用于NSCLC淋巴結微轉移的檢測。表面活性蛋白B(surfactant protein B，SFTPB)是Ⅱ型肺泡細胞分泌的表面活性分子，同時也是肺腺癌淋巴結微轉移檢測指標之一。本研究通過熒光定量PCR技術檢測NSCLC癌組織、組織學陽性的淋巴結及肺良性病變的淋巴結中的SFTPB、TACSTD1、PVA mRNA表達水平，研究其用于NSCLC淋巴結微轉移檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2009年2月至2011年12月的40例非小細胞肺癌及淋巴結標本，其中男性28例，女性12例，平均年齡57.4歲。所有病例均為初治，行肺癌根治術加淋巴結清掃術，均有組織病理診斷證實。腺癌11例，鱗癌25例，其它類型4例(大細胞型肺癌3例，大細胞和小細胞混合型肺癌1例)。臨床分期:Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，Ⅳ期12例。取手術治療20例非肺癌患者淋巴結20枚作為陰性對照。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 手術后標本30 min內取材，小心去除腫瘤和淋巴結上的脂肪組織和血凝塊，用無RNA酶的水沖洗，去除可能污染的腫瘤細胞，每個淋巴結均分2份，一份送病理科進行常規病理檢查，一份存放－80℃保存。

1.2.2 總 RNA提取、cDNA合成及 PCR擴增 總RNA提取使用RNA提取試劑盒(qiagen)，按說明書步驟操作，逆轉錄熒光定量檢測使用試劑盒(takara)，引物在上海生物工程有限公司合成。為了保證逆轉錄PCR擴增產物的可靠性，設計上下游引物時跨內含子，每個逆轉錄cDNA產物均在內參基因擴增出后再進行擴增，設置空白對照和陰性對照管。

1.3 統計學處理

采用ΔCT法對目的基因進行相對表達量的分析［3］，ROC曲線分析腫瘤標志物敏感性、特異性，所有的統計分析均用SPSS10.0計算。

2 結果

2.1 SFTPB、TACSTD1、PVA 基因的表達情況

20例原發性NSCLC肺癌組織，20例組織學陽性淋巴結，20例肺良性疾病淋巴結的SFTPB、TACSTD1、PVA基因相對表達量的分析見圖1。圖中數據顯示腫瘤組織與組織學陽性的淋巴結的基因表達水平無統計學意義，但與肺良性疾病淋巴結的基因表達水平差異顯著(P＜0.05)。將良性淋巴結的最高表達值設為cutoff值(100.0%的特異性)，組織學陽性的淋巴結的敏感性分別為 SFTPB(45.7%)、TACSTD1(100.0%)、PVA(75.4%)。TACSTD1基因在陽性淋巴結與良性淋巴結之間的最小差異倍數為6.2倍。

圖1 SFTPB、TACSTD1、PVA基因在NSCLC肺癌組織及淋巴結中表達情況

2.2 SFTPB、TACSTD1、PVA 基因在不同的組織學類型中的敏感性(表1)

NSCLC主要有3種不同的組織學類型，即腺癌、鱗癌、大細胞肺癌。在100.0%特異性時3種腫瘤標志物在不同的組織學類型中的敏感性各不相同，PVA對鱗癌的敏感性達到100.0%，SFTPB對腺癌的診斷敏感性達到83.2%，TACSTD1對鱗癌腺癌診斷的敏感性均為100.0%。

表1 SFTPB、TACSTD1、PVA基因在不同組織學類型中的敏感性

3 討論

肺癌是我國常見的惡性腫瘤，發病率呈逐年上升的趨勢，而肺癌的5年生存率沒有明顯的提高，據文獻報道進行了完全性切除術的Ⅰ期NSCLC患者總的5年生存率60%～70%［4］，患者多死于肺癌的轉移或復發。因此肺癌的微轉移檢測對于腫瘤切除后分期、復發、轉移及預后的判斷具有重大意義。

目前判斷肺癌是否淋巴結轉移常用手段是病理檢查，但是對于NSCLC的N分期的常規病理檢查的準確性較低。有些腫瘤患者分期低，無明顯轉移證據，但在行癌根治術后卻早期死于癌轉移。這說明患者術前已存在用常規組織病理學方法不能檢出的癌細胞播散或隱性淋巴結轉移。這些微轉移灶和循環癌細胞往往是腫瘤出現顯性轉移和復發的主要原因。因此對常規病理檢查陰性的淋巴結用免疫組化或分子生物學技術進行檢測，檢測結果陽性則認為淋巴結有微轉移。相對于免疫組化，逆轉錄PCR具有以下幾個優點:①檢測的敏感性高，免疫組化的敏感性僅能達到105［5］，而PCR 可達到106，甚至107［6］，較免疫組化高了 1～2 個數量級;②PCR為定性檢查，只要為陽性結果就能明確腫瘤細胞的存在;③檢測指標客觀，主觀因素影響小，而免疫組化需要根據顏色、百分比等判定結果，主觀因素影響大。

Salerno等［7］應用RT-PCR技術檢測MUC1基因，其預測NSCLC患者淋巴結微轉移的敏感性為80%，冼磊等［8］對31例NSCLC患者病理檢查陽性淋巴結檢測MAGE基因1-4，至少1種表達陽性的敏感性達到87.1%。本研究通過熒光定量PCR技術檢測NSCLC癌組織、組織學陽性的淋巴結及肺良性病變的淋巴結SFTPB、TACSTD1、PVA mRNA 表達水平，發現肺癌組織與組織學陽性的淋巴結表達水平相近，與肺良性病變淋巴結的表達水平有顯著性差異。TACSTD1對診斷肺癌淋巴結轉移具有較高的敏感性和特異性，可以作為獨立的診斷指標。在組織學類型分類診斷中PVA對診斷鱗癌有較高的敏感性(100.0%)，SFTPB對診斷腺癌有較高的敏感性(83.2%)。因此SFTPB、TACSTD1、PVA基因聯合檢測可以作為肺癌淋巴結微轉移的分子生物學指標。

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