豬流行性腹瀉病毒的分離及RT-PCR方法的建立

田 野，蘇丹萍，鐘 望，張顯浩，張海明，陳瑞愛,，賀東生*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省人畜共患病重點實驗室，廣州 510642；2.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東 新興 527400）

豬流行性腹瀉屬于冠狀病毒成員，為有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病[1]。在1971 年比利時和英國，該病毒被首次報道，之后在很多養(yǎng)豬國家都暴發(fā)了該病，特別是歐洲和亞洲[2]。我國從1976 年開始陸續(xù)有PED 的報道,20世紀80 年代后該病在中國流行面逐漸擴大,并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[3]。

近幾年我國的廣東、廣西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江蘇、湖北、河北和山東、東北等省（自治區(qū)）的部分地區(qū)，泰國、菲律賓、韓國等亞洲國家的規(guī)模化豬場發(fā)生嚴重的腹瀉病例。在我國2011 年和2012 年形成兩波豬腹瀉病大流行。仔豬腹瀉的病原是復(fù)雜多樣的，根據(jù)對18 個大型豬場的抽樣檢驗，發(fā)現(xiàn)2012 年豬腹瀉主要病原是豬流行性腹瀉病毒。分離病毒，并建立穩(wěn)定的檢測手段，是能更好地防控和研究該病毒的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑盒載體

2012 年2 月份，從華南地區(qū)某大型豬場采集疑似豬流行性腹瀉病料-小腸和肛拭紙。病毒RNA 的提取用經(jīng)典的Trizol 法。MLV、RRI、dNTPs、rTaq購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)Genbank 上登錄的CV777 序列設(shè)計了1 對針對M 基因的特異性引物，Pm1：5'-TGCTTCAGTATGGC CATTACAAGTACTCTG-3'，Pm2：5'-CCTGTCGGCCCATCACAGAAG

TAGT-3'，用于檢測PEDV。以上引物采用PrimerSelect 5.0 軟件設(shè)計，由Invitrogen 上海生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 組織病料PEDV 的RT-PCR檢測及病毒分離

取少量小腸病料，加入1 mol 雙抗，用研磨器進行研磨。將研磨好的組織懸液放入干凈的1.5 mL 離心管中，反復(fù)凍融3 次，5 000 r/min 離心3 min。去250μL 病料上清用Trizol 法抽提組織總RNA。根據(jù)MLV 的說明，取1μLRNA進行反轉(zhuǎn)錄，之后產(chǎn)生的cDNA 進行PCR 檢測。PCR 反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5μL、25μmol/L Pm1 1μL、25μmol/L Pm2 1μL、10 mmol/L dNTP Mix 4μL、rTaq 0.25μL， 滅菌ddH2O 補足至25μL。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個 循 環(huán)，最后72 ℃延 伸10 min。PCR 產(chǎn) 物 用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將陽性病料反復(fù)凍融3 次，過濾膜，接種到vero 細胞，吸附2 h。棄掉毒液，加入含55μg/mL 的DMEM（不含血清），培養(yǎng)72 h，收毒。用同樣的方法，傳到第15 代時細胞出現(xiàn)明顯的病變。

1.4 RT-PCR 方法特異性的檢測

選取臨床上有腹瀉癥狀的其他病毒，如豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒、豬瘟、偽狂犬病病毒等，檢測該RT-PCR 方法的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞病變

病毒在接種vero 細胞前，先與含終濃度55μg/mL 胰蛋白酶的無血清DMEM 作用幾分鐘，然后接種到vero細胞上，加入含終濃度45μg/mL 胰蛋白酶的無血清DMEM 維持液，72 h 后收取病毒液。在前10 代細胞病變不明顯，隨著代數(shù)的增多細胞病變逐漸典型。連續(xù)傳代至第15 代，在vero 細胞上出現(xiàn)典型的空泡狀病變（如圖1）。且傳代后PCR 可以檢測到病毒（如圖2）。

圖1 第15 代PEDV 出現(xiàn)空泡狀的細胞病變

2.2 RT-PCR 方法特異性檢測

根據(jù)臨床癥狀很難區(qū)分豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎和輪狀病毒，因為它們主要病變都是使腸壁變薄，從而引起消化不良性的腹瀉。PCR 方法優(yōu)點就是特異性好，能夠區(qū)分不同的病原。為了檢測RT-PCR 的特異性，選取4種臨床上能出現(xiàn)腹瀉癥狀的病毒（豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒、豬瘟病毒和偽狂犬病病毒），做PCR 檢測，結(jié)果RT-PCR 的特異性高（如圖3）。

2.3 細胞毒不同代次的檢測

分離豬流行性腹瀉病毒很困難，它很難在現(xiàn)有的傳代細胞上出現(xiàn)細胞病變，病毒需要胰蛋白酶的作用才能侵入細胞。在分離病毒前幾代不會出現(xiàn)細胞病變，通過PCR 檢測成了確認病毒存在的主要手段。

豬流行性腹瀉病毒是近幾年造成仔豬腹瀉的主要病原之一。由于病毒很難在現(xiàn)有的細胞系中增殖和出現(xiàn)細胞病變，病毒分離很難，從而對它的研究比較滯后。能成功的分離該病毒，為研究它提供了基礎(chǔ)作用。另一方面在臨床上造成腹瀉的病原較多，建立一個穩(wěn)定成熟的PCR 方法成了當務(wù)之急。豬流行性腹瀉病毒的M 基因非常保守，針對M 基因設(shè)計了一對引物，通過檢測可知，PCR 方法特異性非常好。

[1] Pensaert M B, Debouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine[J]. Arch Virol,1978,58(3):243-247.

[2] Kweon C H , Kwon B J, Jung T S, et al.Korean J Vet Rec 33[M].1993:249-254.

[3] 倪艷秀, 林繼煌, 何孔旺, 等. 豬流行性腹瀉研究概況[J].畜牧與獸醫(yī),2001, 33(1): 38-40.