胰島素樣生長因子-1對小鼠病毒性心肌炎心肌細胞凋亡蛋白p53的表達的影響

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院兒科（十堰442000） 顧 堅 李堰松 顧教偉 李敬風(fēng)

細胞凋亡在病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VM）的病程中發(fā)揮著重要的作用，而在細胞凋亡過程中，p53蛋白起著至關(guān)重要的作用［1］。動物實驗及臨床研究表明：胰島素樣生長因子-l（IGF-1）可增強心臟功能，抑制心肌細胞凋亡。本組通過研究外源性IGF-1對VMC小鼠心肌的保護作用對臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

材料與方法

1 動物與試劑 CVB3Nancy株購自湖北省實驗動物中心病毒室，病毒原液效價為10-6半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50）／ml，Balb／c雄性小鼠60只購自湖北省實驗動物中心。4～6周齡；體質(zhì)量l3～16g。小鼠IGF-1購于深圳達科為生物技術(shù)公司，p53抗體、SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司。

2 心肌炎模型的制備和分組 將小鼠隨機分為感染組20只，治療組20只，每只腹腔接種0.1ml／106TCID50／ml的柯薩奇B3病毒（CVB3）稀釋液；對照組20只，每只腹腔接種0.1ml不含CVB3的Eagles液。治療組從接種病毒稀釋液當(dāng)日開始每天予腹腔注射外源性IGF-1［100μɡ／（kg·d）］，連續(xù)10d。

3 標(biāo)本的留取 各組小鼠于治療后第10天全部斷頸處死并留取心臟。心臟標(biāo)本用40g／L甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，待免疫組織化學(xué)檢測。

4 檢測指標(biāo) 免疫組織化學(xué)S-P法檢測心肌組織中p53表達：石蠟標(biāo)本脫蠟，p53采用微波、高壓抗原修復(fù)，滴加正常動物血清，過夜，滴加一抗為p53兔多克隆抗體（1∶200），4℃過夜，滴加生物素化二抗，滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。陽性結(jié)果判斷：p53陽性表達主要定位于細胞內(nèi)，呈棕黃色顆粒樣。在HPIAS2000型圖像（武漢同濟千屏影像工程公司）分析儀上，每個切片隨機取5個高倍視野，測定一定面積內(nèi)陽性信號面積和陽性信號平均灰度值乘積，陽性信號指數(shù)＝陽性信號面積×陽性信號平均灰度／測定面積×100。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 本組對所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

心肌組織中p53的表達見附表。p53陽性細胞主要為炎性細胞浸潤的周圍心肌細胞。p53陽性表達主要定位于細胞內(nèi)，呈棕黃色顆粒樣分布。

附表 各組小鼠心肌組織p53灰度值比較（±s）

附表 各組小鼠心肌組織p53灰度值比較（±s）

注：★與對照組比較，P＜0.01；＃與治療組比較，P＜0.01

組 別 n p53對照組 20 118.6±10.4感染組 20 167.9±15.6★＃治療組 20 123.5±11.2

討 論

VMC是常見的心血管疾病，其發(fā)病機制目前仍不完全清楚。但近年的研究已證明其損害心臟的主要機制包括兩個方面：即病毒對被感染心肌的直接損害和病毒觸發(fā)人體免疫反應(yīng)而引起心肌損害。其中，炎性細胞浸潤所誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中占有重要作用［2］。機體中的IGF-1主要由肝細胞分泌，部分來自組織的自分泌或旁分泌。研究表明：IGF-1對心臟具有重要的生物學(xué)效應(yīng)，能提高心肌梗死后、心力衰竭、擴張型心肌病及正常心肌功能，具有促進心肌修復(fù)和組織重構(gòu)，擴張冠狀動脈，保護缺血心肌的作用［3］。目前關(guān)于IGF-1與VMC關(guān)系的報道非常少見。心肌組織的IGF-1除來自血液循環(huán)外，其本身也具有分泌IGF-1能力。在胚胎、出生后及成年鼠心肌中均可檢測到IGF-1mRNA和IGF-1蛋白［4］。

細胞凋亡為細胞在生理或病理狀態(tài)下有序死亡過程。在VMC中，細胞凋亡是伴隨心肌局部炎性細胞浸潤的一種重要形式。p53蛋白是目前公認的促細胞凋亡蛋白，其本質(zhì)是一種核磷酸蛋白，在細胞DNA損傷時，p53轉(zhuǎn)譯水平會升高，使細胞停滯于G1期進行DNA的修復(fù)，如果不能完成DNA的修復(fù)，可促使其走向凋亡［5］。病毒性心肌炎可導(dǎo)致心肌缺血再灌注，產(chǎn)生大量的氧自由基，對DNA造成損傷，p53蛋白表達增多，可下調(diào)Bcl-2基因，上調(diào)Bax基因，從而促進細胞凋亡［6］。

隨著對IGF-1研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)IGF-1在調(diào)節(jié)凋亡方面起著重要作用［7-8］。牽張試驗發(fā)現(xiàn)：將大鼠離體心肌預(yù)先用IGF-1處理后，與對照組相比，心肌牽張6、20h后細胞凋亡分別下降43%，61%［9］。Liu等［10］研究結(jié)果顯示：在動物心肌梗死模型中予IGF-1，與對照組相比，4周后心肌細胞凋亡明顯減少。IGF-1作為一種細胞凋亡的抑制調(diào)控因子，主要是通過與特異性的靶細胞表面受體結(jié)合而發(fā)揮功能。其抗凋亡的主要效應(yīng)器路徑為：IGF-1與受體結(jié)合后，PI3激酶被激活并磷酸化，導(dǎo)致前凋亡因子BAD的內(nèi)聚，從而阻止了BAD與抗凋亡蛋白Bcl-2在線粒體膜上形成二聚體。Bcl-2的單體形式能與Bax的誘凋亡作用相拮抗，形成二聚體后即失去了抗凋亡的活性［11］。IGF-1抗凋亡路徑的最終效應(yīng)是抑制了凋亡蛋白Caspase［12］。本研究顯示：感染組p53的表達增高，而在IGF-1治療組，p53的表達明顯下降，提示IGF-1通過抑制p53的表達來抑制凋亡。

隨著IGF-1作用機制闡明，應(yīng)用IGF-1治療VMC可能將是一種有效的方法。目前IGF-1已探索性地用于治療心肌細胞凋亡［13］。但其長期療效和不良反應(yīng)需進行更多的動物實驗和臨床研究來闡明。

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