大鼠骨髓間充質干細胞在淋巴細胞增殖中的免疫調節作用＊

天津醫科大學第一中心臨床學院衛生部危重病急救醫學重點實驗室（天津300192） 郭瑞雪 沈中陽 宋紅麗 杜杰靜 張 靜 鄭衛萍 王玉亮

肝移植是治療終末期肝病的主要手段之一，但是移植后排斥反應嚴重影響了療效和預后。這種排斥反應主要與T細胞介導的免疫應答相關。MSCs低表達主要組織相容性復合體-Ⅰ（MHC-Ⅰ）類分子，不表達MHC-Ⅱ類分子和 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD40或CD40L等共刺激分子，這些特性使得其具有低免疫原性，能夠導致T細胞無能，從而抑制免疫排斥或誘導免疫耐受，降低移植排斥發生率［1］。本實驗旨在建立體外共培養體系研究BM MSCs對淋巴細胞增殖的抑制機制，現分析報告如下。

材料與方法

1 材料與試劑

1.1 實驗動物：Wista大鼠，雄性，體重100～120g，SPF級，4～5周齡，購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑：DMEM／F12培養基（Hyclone公司，美國），Percoll淋巴細胞分離液（Amersham Bioscience公司，美國），胎牛血清（PAA公司，奧地利），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），ELISA盒（R＆D System，美國），正常大鼠BRL細胞（中科院上海細胞生化所），抗大鼠的 CD45-PE、CD90-FITC、CD34-FITC、CD29-PE、RT1A-PE、RT1B-FITC、IgG-FITC和IgG-PE（Biolegend公司，美國），抗大鼠的 CD4-FITC、CD25-PE、Foxp3-PE-Cy5（eBioscience公司，美國）。

2 實驗方法

2.1 大鼠MSCs的分離和培養：全骨髓培養法分離培養MSCs。具體方法：用5%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠致死，75%乙醇浸泡3min，無菌條件下取其脛骨股骨。剪去其兩端骨骺，于10cm2培養皿內使用含15%FBS的DMEM高糖培養基沖洗骨髓腔，制成單細胞懸液。置于含15%FBS、100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素的DMEM高糖培養基中。37℃，5%CO2、飽和濕度條件下培養48h后換液。此后每2～3d換液1次，細胞生長至80%左右融合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取第3代MSCs細胞，調整細胞濃度為2×105／ml備用。

2.2 流式檢測大鼠MSCs的表型鑒定：收集生長良好的第3代 MSCs，消化、計數，使細胞濃度為1×106／L，分別加入1.25μl的抗體 CD45、CD29、RT1A，0.5μl的抗體CD90、RT1B，20μl的抗體CD34，同時用IgG作為陰性對照，共孵育30min后，用PBS洗滌，經流式細胞儀檢測。

2.3 大鼠脾臟淋巴細胞的制備：用5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠致死，無菌條件下取出脾臟，用200目尼龍網研磨后，應用淋巴細胞分離液獲得淋巴細胞，DMEM低糖培養基洗滌2次。調整細胞濃度為1×106／ml備用。

2.4 BRL的制備：將BRL細胞加入10%FBS的DMEM高糖培養基接種于培養瓶，37℃，5%CO2培養，最后調整細胞濃度2×105／ml備用。

2.5 MSCs細胞與淋巴細胞共培養：將淋巴細胞、MSCs、BRL和ConA分別分組接種于6孔培養板，每組3個副孔，每孔總量4ml。

2.6 實驗分組：①淋巴細胞組；②淋巴細胞+ConA組；③淋巴細胞+ConA+MSCs組；④淋巴細胞+ConA+MSCs+BRL組。37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養0h、24h和48h。

2.7 ELISA定量檢測各組培養上清中TNF-α、TGF-β1、IL-10的含量：待各組共培養0h、24h和48h后收集上清，方法按試劑說明書進行。

2.8 MTT法淋巴細胞混合反應：將MSCs，淋巴細胞，BRL和ConA接種于96孔板，共培養0h、24h和48h后MTT法檢測淋巴細胞相對細胞數。

2.9 流式檢測Treg含量：取共培養上清液以2500rpm離心5min，棄去上清留下細胞沉淀，按照說明書進行流式檢測準備工作。

3 統計學處理 本研究對所有數據采用SSPS17.0統計學軟件進行分析處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 骨髓MSCs的形態學觀察及表型鑒定

1.1 形態學觀察：見圖1。剛接種下的骨髓MSCs呈大小較均一的圓形，胞膜清晰，胞體透亮。6h后開始貼壁，48h已牢固貼壁，生長速度較慢，4～5d后可有偽足伸展，以后成為長梭形細胞，出現明顯集落，在10d左右可以呈現80%融合。消化傳代后細胞平均4～5d再次傳代，細胞形態較為均一。

1.2 表型鑒定：見圖2。CD90、CD29和RT1A陽性，CD45、CD34和RT1B陰性，說明我們所提取培養的細胞正是骨髓MSCs。

圖1 MSCs的體外培養（倒置相差×100）

2 ELISA法檢測各組培養上清中3種細胞因子分泌量 見表1。24h和48h的3、4組TGF-β1和IL-10較1、2組表現高分泌（P＜0.05），TNF-α表現低分泌（P＜0.05），0h基本沒有變化，TGF-β1分泌隨時間延長增高，但IL-10變化不明顯（P＞0.05）。

圖2 MSCs流式表型鑒定

表1 各組24h和48h的 TNF-α、TGF-β1 和IL-10分泌量（±s，ng／L）

表1 各組24h和48h的 TNF-α、TGF-β1 和IL-10分泌量（±s，ng／L）

注：1組為淋巴細胞；2組為淋巴細胞+ConA；3組為淋巴細胞+ConA+MSCs；4組為淋巴細胞+ConA+MSCs+BRL

TNF-α IL-10組 別TGF-β 0h 24h 48h 0h 24h 48h 0h 24h 48h 1組 2.73±0.21 21.89±0.64 7.70±2.69 71.27±2.98 151.78±5.95 199.67±11.16 55.21±3.26 65.05±1.48 59.920±1.93 2組 2.76±0.16 79.71±4.74 3組 2.75±0.25 25.35±0.36 34.25±1.07 70.74±10.42 201.51±7.81 241.50±4.09 54.58±1.48 85.48±6.37 171.05±14.52 t（2：1） 0.19 6.63 12.96 -0.07 7.16 4.98 -0.25 4.42 5.47 t（3：1） 0.07 -4.46 5.49 -0.73 7.19 12.58 0.10 74.71 26.66 t（3：2） -0.10 -19.20 -14.11 -0.35 4.62 11.23 0.34 13.17 7.83 t（3：4） -0.35 29.95 13.10 -0.43 -5.60 -5.24 -0.27 -5.34 -6.16 t（4：2） 0.32 -31.41 -33.63 -0.05 21.47 10.53 1.03 13.97 8.46 P（2：1） 0.87 0.022 0.006 0.95 0.019 0.038 0.83 0.048 0.032 P（3：1） 0.95 0.047 0.032 0.54 0.019 0.006 0.93 0.000 0.001 P（3：2） 0.93 0.003 0.005 0.76 0.044 0.008 0.77 0.006 0.016 P（3：4） 0.76 0.001 0.006 0.71 0.030 0.035 0.82 0.033 0.025 P（4：2） 0.78 0.001 0.001 0.97 0.002 0.009 0.41 0.005 0.014 107.47±1.63 4組 2.83±0.26 19.76±0.20 18.98±1.10 67.74±6.18 294.92±27.54 387.01±17.86 55.56±3.75 144.86±0.30 3.34±0.75 8.80±0.07 70.33±5.73 413.06±11.54 556.20±42.05 56.35±1.93 160.57±4.15

3 MTT法檢測MSCs對淋巴細胞增殖作用結果見表2。24h和48h的3、4組OD值較1、2組降低（P＜0.05），0h基本沒有變化（P＞0.05）。

4 流式檢測Treg含量結果 見圖3。24h和48h的3、4組Treg含量均較1、2組增高（P＜0.05），并且48h含量較高于24h（P＜0.05）。

表2 各組24h和48h的OD值（±s）

表2 各組24h和48h的OD值（±s）

注：1組為淋巴細胞；2組為淋巴細胞+ConA；3組為淋巴細胞+ConA+MSCs；4組為淋巴細胞+ConA+MSCs+BRL

組 別 0h 24h 48h 1組 0.459±0.038 0.353±0.024 0.415±0.024 2組 0.480±0.020 0.563±0.025 0.557±0.021 3組 0.449±0.029 0.229±0.023 0.371±0.023 4組 0.485±0.019 0.104±0.013 0.226±0.032 t（2：1） -1.01411.980 9.023 t（3：1） -1.786-7.441-2.665 t（3：2） -0.421-19.578-11.995 t（3：4） -2.055 9.404 7.407 t（4：2） 1.460-32.208-17.373 P（2：1） 0.350 0.000 0.000 P（3：1） 0.124 0.000 0.037 P（3：2） 0.689 0.000 0.000 P（3：4） 0.086 0.000 0.000 P（4：2） 0.195 0.000 0.000

討 論

骨髓MSCs主要有賴于其免疫表型而被識別，我們對分離擴增后的骨髓MSCs的表面標志進行了流式細胞儀檢測，結果表明骨髓MSCs高表達CD90、CD29和RT1A，不表達CD45、CD34和RT1B，與文獻報道一致［2］。許多研究已表明：MSCs可以抑制同種異體抗原對T細胞刺激的反應，但具體機制尚不清楚。有研究認為骨髓MSCs發揮作用是通過細胞-細胞接觸，但是更多則認為是通過分泌可溶性因子實現的［3］。本實驗建立體外共培養系統觀察MSCs對淋巴細胞的影響，檢測發現抑炎細胞因子TGF-β1和IL-10的含量在含有骨髓MSCs組均顯著增高，促炎細胞因子TNF-α含量降低，以及Treg含量增高，說明MSCs能夠促進負性免疫應答。

圖3 Treg流式圖

TGF-β1是免疫系統中良好的負性調節因子，能夠誘導自身耐受和器官耐受，維持免疫平衡［4］。Bertolo等［5］將 MSCs與外周血淋巴細胞共培養發現TGF-β1表達增加。Qian等［6］等的研究也證實了TGF-β1在MSCs對淋巴細胞的抑制作用中非常重要，我們的實驗結果與之一致，同時證明了這種作用隨時間延長幾乎沒有改變。

IL-10是另一重要的負性免疫調節因子，能夠抑制單核／巨噬細胞 MHC-Ⅱ類分子，間接降低T細胞增殖。Gao等［7］發現IL-10在MSCs發揮抑制作用中有著重要作用。這與我們的實驗結果一致，但是有部分學者認為：在MSCs對淋巴細胞抑制過程中，IL-10的分泌量沒有增加，其具體機制有待證實。

TNF-α除致炎作用外，還能夠促進T細胞、胸腺細胞以及B細胞等的增殖和分化，參與某些免疫病理過程。方 翔［8］等經動物實驗發現骨髓MSCs移植能夠降低肺氣腫大鼠血漿中TNF-α的含量。這與我們實驗結果相同，說明骨髓MSCs能夠通過降低TNF-α的分泌來減弱淋巴細胞的增殖和分化。

Treg是一類表面高表達IL-2受體α鏈（CD25）、胞質中表達Foxp3轉錄因子的CD4+T細胞，能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖，達到負性調節以及自身免疫耐受的作用。Wang等［9，10］經動物實驗發現：骨髓MSCs移植能夠顯著增加外周血和淋巴結中Treg的含量，抑制急性排斥反應，延長受鼠的生存時間。我們的體外實驗得到了相同結果，這表明MSCs能夠通過提高Treg含量抑制淋巴細胞增殖。

肝臟作為“免疫特惠器官”表現一定程度的天然免疫耐受性，移植排斥反應發生率和嚴重度較少較輕，但是這仍然是移植失敗的一個主要因素。我們在共培養體系中加入BRL，想由此來了解骨髓MSCs在大鼠正常肝細胞存在情況下是否仍然對淋巴細胞起到抑制作用。

總之，骨髓MSCs具有抗炎和免疫調節的能力，使其成為治療免疫系統紊亂引起的疾病的潛在方法，例如移植后排斥反應。

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