異種抗原免疫及瘤內注射誘導淋巴細胞殺傷S180細胞的研究

司曉燕 高言寶

腫瘤免疫治療是目前研究的熱點之一，但由于腫瘤的低免疫原性和機體對腫瘤的低免疫反應性，使得免疫治療受到限制。細胞毒T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性在機體抗腫瘤效應中起關鍵作用[1]。研究發現腫瘤微環境處于免疫抑制狀態，樹突狀細胞(DC)不能有效地遞呈抗原[2]，因而不能誘導CTL殺傷腫瘤細胞。細菌及其制劑是最早采用的非特異性免疫刺激劑，研究發現它們能激發和增強機體的特異與非特異免疫機能，達到抗腫瘤作用。血型抗原亦可引起很強的抗血型免疫反應，可能激發和增強機體的特異與非特異免疫機能。本研究是利用兩種異種抗原(滅活鏈球菌和A型血型抗原)瘤內注射并配合全身免疫來治療腫瘤，將抗細菌、抗血型免疫反應和二次免疫應答引入腫瘤局部，希望能夠改善腫瘤局部的免疫抑制微環境，打破免疫耐受，使DC遞呈腫瘤抗原，誘導CTL殺傷腫瘤細胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胎牛血清、RPMI1640培養液、PBS、小鼠紅細胞裂解液及MTT試劑盒均購自普利萊基因技術有限公司。滅活鏈球菌粉劑(α-溶血性鏈球菌經60Co機照射24 h滅活)及人A型血型抗原由南方醫科大學珠江醫院腫瘤中心實驗室提取。利用血型抗原免疫及瘤內注射來治療腫瘤的實驗方法已申請專利，專利號為200810029547.9。

1.1.2 實驗動物及腫瘤細胞株 試驗用動物為4～6周齡昆明種小鼠，體重18～20 g，雌雄兼用，購自南方醫科大學動物實驗中心。小鼠肉瘤S180細胞株由南方醫科大學藥學院惠贈。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組:昆明小鼠42只，每組6只，隨機分為7組:①滅活鏈球菌全身免疫及瘤內注射組。②滅活鏈球菌僅全身免疫組。③滅活鏈球菌僅瘤內注射組;①A型血型抗原全身免疫及瘤內注射組。②A型血型抗原僅全身免疫組。③A型血型抗原僅瘤內注射組。④空白對照組。

1.2.2 小鼠實體瘤制作方法 先制作S180腹水型小鼠，再從小鼠腹腔無菌抽取癌腹水，制成癌細胞懸液，調整細胞濃度為1×107個/ml，取0.1 ml用于小鼠背部皮下接種以制作實體瘤模型，成瘤率近100%[3]。

1.2.3 造模過程 前兩周用異種抗原全身免疫小鼠4次，2次/周(A、B組小鼠腹腔注射濃度為0.1 g/ml的滅活鏈球菌0.1 ml/只;a、b組小鼠腹腔注射濃度為5 mg/ml的A型血型抗原0.1 ml/只;同時C、c、D(d)組小鼠均腹腔注射生理鹽水0.1 ml/只)。然后于7組小鼠背部皮下接種濃度為1×107個/ml的S180細胞0.1 ml/只，約兩周長成大小為1 cm3左右的腫塊，隨后連續5 d瘤內注射異種抗原(A、C組小鼠瘤內注射濃度為0.1 g/ml的滅活鏈球菌0.1 ml/只/;a、c組小鼠瘤內注射濃度為5 mg/ml的A型血型抗原0.1 ml/只;同時B、b、D(d)組小鼠均瘤內注射生理鹽水0.1 ml/只)。瘤內注射結束3 d后，處死小鼠。

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞懸液的制備 參照文獻[4]進行，為殺傷試驗提供效應細胞。

1.2.5 靶細胞懸液的制備 常規培養小鼠肉瘤S180細胞，為殺傷實驗提供靶細胞。

1.2.6 體外殺傷活性測定 用MTT比色法測定不同處理組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的體外殺傷活性[5]。調整脾淋巴細胞濃度為2×106個/ml，S180細胞濃度為1×105個/ml，效應細胞:靶細胞(E∶T)=20∶1。取效應細胞和靶細胞各100ul加入到96孔板，5%CO2，37℃培養24 h后，加入5 mg/ml的 MTT 10ul，繼續培養 4 h，1000r/min 離心 5 min，棄上清加150ul二甲基亞砜震蕩，待藍紫色沉淀溶解后，用酶聯儀于波長570nm處測定，讀取A值，同時設空白對照、靶細胞對照(T)、效應細胞對照(E)，每組均設三個復孔，取其均值，按下式計算殺傷活性:

2 結果

2.1 滅活鏈球菌實驗4組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷率見表1。經總體方差分析處理組間差異有顯著性(F=366.675，P=0.000)。經多重比較，滅活鏈球菌全身免疫及瘤內注射組脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性顯著高于滅活鏈球菌僅全身免疫組、滅活鏈球菌僅瘤內注射組和空白對照組(P=0.000，P=0.000和P=0.000);同時滅活鏈球菌僅瘤內注射組也高于滅活鏈球菌僅全身免疫組和空白對照組(P=0.000和P=0.000);而滅活鏈球菌僅全身免疫組和空白對照組卻無顯著性差異(P=1.000)。

表1 4組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性(A值，±s)

表1 4組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性(A值，±s)

小組 樣本數 殺傷率(A)滅活鏈球菌全身免疫及瘤內注射組6 9.85%±2.76%6 63.17%±3.94%(B)滅活鏈球菌僅全身免疫組 6 10.26% ±1.95%(C)滅活鏈球菌僅瘤內注射組 6 33.30% ±3.82%(D)空白對照組

2.2 A型血型抗原實驗4組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷率見表2。經總體方差分析處理組間差異有顯著性(F=437.790，P=0.000)。經多重比較，A型血型抗原全身免疫及瘤內注射組脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性顯著高于A型血型抗原僅全身免疫組、A型血型抗原僅瘤內注射組和空白對照組(P=0.000，P=0.000和P=0.000);同時A型血型抗原僅瘤內注射組也高于A型血型抗原僅全身免疫組和空白對照組(P=0.000和P=0.000);而A型血型抗原僅全身免疫組和空白對照組卻無顯著性差異(P=1.000)。

表2 4組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性(A值，±s)

表2 4組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性(A值，±s)

6 9.85%±2.76%6 76.27%±4.07%(b)A型血型抗原僅全身免疫組 6 10.55% ±2.29%(c)A型血型抗原僅瘤內注射組 6 40.92%±4.98%(d)空白對照組小組 樣本數 殺傷率(a)A型血型抗原全身免疫及瘤內注射組

2.3 兩種異種抗原免疫及瘤內注射激活的小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性比較:經兩樣本t檢驗，A型血型抗原全身免疫及瘤內注射組的殺傷活性高于滅活鏈球菌全身免疫及瘤內注射組(t=5.662，P=0.000);A型血型抗原僅瘤內注射組的殺傷活性也高于滅活鏈球菌僅瘤內注射組(t=2.973，P=0.014)。

3 討論

目前腫瘤免疫治療研究的熱點主要集中在抗癌效應細胞、細胞因子、抗癌抗體、瘤苗及基因治療的各個方面。腫瘤抗原與免疫耐受是腫瘤免疫的兩個最重要的主題，如何增強腫瘤細胞免疫原性及打破腫瘤免疫耐受狀態，是設計腫瘤免疫治療方案時首先要考慮的問題?？鼓[瘤免疫效應一般以細胞免疫為主，尤其是細胞毒T淋巴細胞(CTL)的殺傷活性在機體抗腫瘤效應中起關鍵作用[6]。腫瘤抗原的識別、加工、提呈及T淋巴細胞的致敏、激活依賴于抗原提呈細胞(APC)。樹突狀細胞(DC)是目前已知體內抗原呈遞功能最強的APC[7]。研究發現腫瘤局部微環境處于免疫抑制狀態，其內的細胞免疫亦存在著一個復雜的調節網絡[8]。在腫瘤患者體內，DC處于失活狀態，表現為數量減少及表型和功能上的缺陷[9]。由于DC的生物學功能是在體內遷移的過程中體現的，根據DC遷移的特點，可以通過介導腫瘤部位招募非成熟DC、激活腫瘤浸潤樹突狀細胞(TIDC)和促進已攝取抗原的DC遷移至淋巴結，以激活CTL來提高腫瘤免疫治療作用[10]。因此如何改善腫瘤局部的免疫抑制微環境，在腫瘤局部原位募集DC細胞、T細胞等免疫細胞，并使DC遞呈腫瘤抗原，則能誘導CTL特異性殺傷腫瘤細胞活性。

19世紀末，William Coley便開始采用混合的細菌毒素(Coley毒素)來治療惡性腫瘤，Coley毒素即是最早采用的非特異性免疫刺激劑，以后發展了多種非特異性免疫刺激劑，如卡介苗(BCG)、棒狀桿菌等，尤其是BCG膀胱灌注治療膀胱癌獲得了成功[11]。一些細菌等非特異性免疫刺激劑依靠很強的抗原性，能激發和增強機體的特異與非特異免疫機能，達到抗腫瘤作用。同時血型抗原是一類具有很強的免疫原性和抗原性的同種異型抗原，將其于腫瘤局部注射也將激發機體很強的抗血型免疫反應。由于二次體液免疫應答具有高效、快速等特點，若將抗細菌、抗血型免疫反應和二次免疫應答引入腫瘤局部，則可能改善腫瘤局部免疫抑制狀態，促進DC遞呈腫瘤抗原，從而激發CTL特異性殺傷腫瘤細胞活性。

本實驗是利用兩種異種抗原(滅活鏈球菌和A型血型抗原)瘤內注射并配合全身免疫來治療腫瘤，將抗細菌、抗血型免疫反應和二次免疫應答引入腫瘤局部，取得了較為理想的結果。異種抗原僅全身免疫組和空白對照組小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷作用很弱，主要是它的非特異性細胞毒作用所致。而異種抗原全身免疫及瘤內注射組的殺傷活性卻很強，異種抗原僅瘤內注射組的殺傷活性也有所提高，其抗腫瘤免疫反應的機制可能有以下幾個方面:①異種抗原與抗體結合，引起腫瘤局部炎癥反應，產生大量細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，它們具有較強的抗腫瘤及免疫調節作用。②聚集Mф細胞、NK細胞、DC細胞和T細胞等非特異和特異性免疫效應細胞，NK細胞和Mф細胞可直接發揮抗腫瘤作用，同時IL-2等可增強其抗腫瘤作用[12]。③隨著腫瘤細胞萎縮死亡，腫瘤抗原暴露，趨化到腫瘤局部的未成熟DC及TIDC識別腫瘤抗原，遞呈腫瘤抗原給CD8+T細胞，CTL活化、增殖，殺傷腫瘤細胞。

經比較兩種異種抗原激活的小鼠脾淋巴細胞對S180細胞的殺傷活性，我們發現A型血型抗原的效果更好一些。血型抗原還具有取材方便、應用簡單等特點。本實驗的不足之處是沒有檢測腫瘤局部的相關免疫細胞、細胞因子，尤其是DC細胞的免疫狀態，來驗證其確實遞呈了腫瘤抗原，激活了CTL，所以仍需更深入的研究本實驗方法的機理，并完善此方法。

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