發酵法生產杏鮑菇菌絲體*

郭 霞，楊海燕，張雪娥，吳慧珍，張 琴

(重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331)

杏鮑菇 (Pleurotus eryngii)學名刺芹側耳，隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、無隔擔子菌亞綱、傘菌目、側耳科、側耳屬 (Pleurotus)[1]。杏鮑菇是近年來引進開發的一種優質食用菌，在全國各地均有栽培，其菌蓋肥厚，菌柄粗大而中實，質地脆嫩細膩，具有杏仁香味，又有鮑魚口感，有“草原上的美味牛肝菌”、“平菇王”的美譽。此外，杏鮑菇子實體蛋白質含量較高，脂肪和總糖含量較低，富含礦物質和維生素，具有抗癌、抑制腫瘤和美容的功效，在食品及醫藥領域具有廣闊的開發及應用前景[2，3]。

目前，由液體發酵法生產菌絲體及胞外產物的方法，具有發酵周期短、容易操作、不受季節限制等優點，越來越受到研究者的關注。研究適宜杏鮑菇菌絲生長的培養基，不僅可以為工業化生產菌絲及胞內產品開發提供理論依據，還有利于人工栽培縮短菌絲生長時間，從而提高生產效率。因此，探索一種有利于杏鮑菇菌絲體生長的培養基非常必要。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試杏鮑菇菌株由組織分離獲得，子實體購于重慶盤溪市場，由重慶師范大學生命科學學院微生物研究所研究人員鑒定保存。

1.2 種子液的制備

種子培養基:馬鈴薯 200.0 g·L－1、葡萄糖 11.0 g·L－1、蛋白胨 2.0 g·L－1、KH2PO43.0 g·L－1、MgSO41.0 g·L－1、VB10.01 g·L－1，水1 000.0 mL。從活化的 PDA培養菌種上取3塊0.5 cm2的菌塊，接入搖瓶中，溫度 (27±0.5)℃，180 r·min－1培養 168 h，制得液體種子液[4]。

1.3 測定方法

1.3.1 菌絲生物量的測定

將發酵液真空抽濾，用蒸餾水清洗干凈后，收集菌絲體，(60±0.5)℃下烘干至恒重，電子天平稱重。

1.3.2 油的測量

取5.0 mL發酵液，按照1∶2的體積加入乙醚，添加到分液漏斗中震蕩，分層后去掉下層，上清液放入稱量杯中，(60±0.5)℃烘干稱重。

1.4 碳源對菌絲生長的影響

1.4.1 糖種類篩選

基礎培養基:葡萄糖 20.0 g·L－1、蛋白胨 5.0 g·L－1、MgSO41.0 g·L－1、KH2PO40.5 g·L－1、VB10.01 g·L－1，水1 000.0 mL，pH 6.0。

分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖代替基礎培養基中的葡萄糖，以基礎培養基做對照，每個配方做3個重復。接種量5.0%，每250 mL裝液100 mL，培養溫度(27 ±0.5)℃、轉速180 r·min－1，震蕩培養168 h。

1.4.2 植物油篩選

在基礎培養基中分別添加10.0 g·L－1芝麻油、花椒油、蔥油、大豆油、辣椒油、菜籽油、瓜子油[5]，培養方法同1.4.1。

1.5 氮源對菌絲生長的影響

分別用硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、麥麩代替基礎培養基中的氮源蛋白胨，以基礎培養基做對照，培養方法同1.4.1。

1.6 正交實驗

在單因素試驗的基礎上，選取可溶性淀粉、牛肉膏、蔥油做三因素三水平的正交設計，共9個組合 (表1)。

1.7 發酵過程分析

利用搖瓶實驗比較了正交實驗優化后和優化前發酵液在0～168 h的生物量、pH和殘油量變化，每個樣品3個重復，試驗因子水平表見表1。

表1 正交試驗因子水平表L9(34)

2 結果與分析

2.1 碳源對菌絲生長的影響

2.1.1 碳源對菌絲生長的影響

碳源對菌絲生物量的影響見表2。

表2 碳源對菌絲生物量的影響

由表2可見杏鮑菇對可溶性淀粉利用較好，菌絲干重達到(18.516±1.959)g·L－1，其次是葡萄糖，菌絲干重達到(12.812±0.231)g·L－1。蔗糖、麥芽糖、甘油、乳糖分別為碳源時，菌絲干重分別達到 (11.732±0.72)g·L－1、(11.315±0.603)g·L－1、(11.211 ±0.217)g·L－1、(9.016 ±0.048)g·L－1。通過單因素方差分析，杏鮑菇菌絲體以可溶淀粉為碳源時，能顯著提高菌絲產量 (p＜0.05)。以乳糖為碳源時，生物量顯著降低。因此，選擇可溶性淀粉進行下一步試驗。

2.1.2 植物油對菌絲生長的影響

通過單因素方差分析，結果見表3。

表3 不同植物油對菌絲生物量的影響

從表3可知植物油能顯著提高菌絲產量 (p＜0.05)。其中，添加蔥油后菌絲生物量最大，達 (35.467±0.091)g·L－1，其次是辣椒油、瓜子油、大豆油、花椒油、芝麻油、菜籽油。

2.2 氮源對菌絲生長的影響

氮源對菌絲生物量的影響見表4。

表4 不同氮源對菌絲生物量的影響

由表4可知，有機氮源更適宜菌絲生長，牛肉膏為氮源時可獲得最大生物量 (19.056±0.241)g·L－1，生物量顯著提高 (p＜0.05)，其次是蛋白胨和酵母膏。硫酸銨或硝酸銨為唯一氮源時，菌絲產量顯著下降。

2.4 正交實驗優化結果

正交試驗優化結果、方差分析結果見表5、表6。

表5 正交試驗優化結果

表6 方差分析

通過正交試驗的極差分析及方差分析，表5中極差R為同一因素中各水平的實驗指標總和的最大與最小值之差，其大小表示各因素水平的變化對實驗指標的影響。各因素的影響依次為蔥油＞牛肉膏＞可溶性淀粉，與表6中方差分析結果一致。方差分析結果顯示，蔥油和牛肉膏濃度對生物量具有顯著影響 (p＜0.05)，可溶性淀粉濃度對生物量的影響未達到顯著水平。因此，從節約成本出發，最優組合為A1B3C3即7 號培養基，淀粉 10.0 g·L－1、牛肉膏 10.0 g·L－1、蔥油15.0 mL·L－1，可獲得最大生物量 35.672 g·L－1。

2.5 發酵過程分析

杏鮑菇菌絲發酵過程分析見圖1。

通過圖1發酵過程曲線分析，優化前生物量明顯比優化后生物量低，可見培養基優化后生物量明顯提高。在0～96 h蔥油迅速被菌絲利用完，在120 h菌絲生物量達到最大(35.810±3.232)g·L－1，而對照在 168 h才達到最大生物量 (17.223±0.401)g·L－1。優化后的發酵液pH從24 h～120 h迅速降低，120 h時pH降到最低5.0，120 h后逐漸升高，而對照組在0～168 h呈現逐漸下降的趨勢，說明優化后的培養基中菌絲代謝更旺盛，產生了大量酸性物質，導致pH降低。

3 討論

單因素試驗結果表明，不同營養物質對菌絲生長有顯著影響。蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、乳糖、葡萄糖分別為碳源時，可溶性淀粉為最適碳源;植物油能顯著促進菌絲生長，在辣椒油、瓜子油、大豆油、蔥油、花椒油、芝麻油、菜籽油中，添加10.0 g·L－1蔥油后，菌絲生物量最大。Wardle[6]等也發現將類脂加到香菇的基礎培養基中，促進了蘑菇菌絲體生長。趙明亮[7]等通過香菇液體發酵，發現油能促進香菇菌絲生長。Yang[8]等在灰樹花深層培養中，發現每100毫升0.15 g油酸能促進菌絲生長，棕櫚酸也能促進多糖合成，但是每100毫升0.1 g亞油酸能顯著抑制菌絲和多糖的合成。鄒祥等[5]在藥用真菌桑黃的液體發酵中也發現菜籽油能提高桑黃菌絲的生物量，但是對胞外多糖具有顯著抑制作用，其機理可能是植物油促進了細胞膜的通透性，有利于菌絲對培養基營養成分的吸收，從而促進菌絲生長。有機氮源比無機氮源更有利于杏鮑菇菌絲生長，硫酸銨、硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨中，牛肉膏為最適氮源。

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗優化菌絲生長培養基，最優組合為淀粉 10.0 g·L－1、牛肉膏 10.0 g·L－1、蔥油 150.0 g·L－1，菌體生物量可達 35.672 g·L－1。其中，蔥油和牛肉膏濃度是提高產量的重要因素。根據發酵過程分析，優化后的培養基能顯著促進菌絲生長代謝，提高了菌絲生物量，說明優化后的培養基確實更適合菌絲生長。

雖然對杏鮑菇工業化人工栽培的報道較多，但是通過液體培養獲得大量菌絲體的報道較少，尤其是在添加植物油能顯著提高生物量、縮短菌絲生長時間方面還未見文獻報道。在優化的培養基下菌絲生物量明顯增加，其菌絲形態結構、胞內菌絲多糖含量及結構變化等研究工作正在進行中，希望能對杏鮑菇人工栽培，提高菌絲及胞內產物產量提供理論參考。

[1]金周雨，李艷麗，王雪.杏鮑菇菌絲體水溶性多糖提取及培養條件優化 [J].菌物研究，2009，7(2):57－61.

[2]王鳳芳.杏鮑菇中營養成分的分析測定 [J].食品科學，2002，23(4):132－135.

[3]潘崇環，孫萍.珍稀食用菌栽培與名貴野生菌的開發利用 [M].北京:中國農業出版社，2004.

[4]何莉莉，韓成玲，范文麗，等.礦質元素對北蟲草繼代培養不同菌落子實體產量及菌絲生長速度的影響[J].微生物學通報，2010，37(9):1331－1340.

[5]鄒祥，郭霞，孫敏.前體對桑黃菌絲生長和胞外多糖合成的影響[J].食品科學，2010，31(21):262－265.

[6]張郁松，蠶蛹油超臨界萃取與有機溶劑萃取的比較研究[J].糧油加工，2009(2):45－46.

[7]趙明亮，鄧世瑜.油與香菇菌絲生長的關系 [J].食用菌，1987(26):19－20.

[8]Yang FC，Ke YF，Kuo SS.Effect of fatty acids on the mycelial growth and polysaccharide formation by Ganoderma lucidum in shake flask culture[J].Enzyme and Microbialogy Technology，2000(27):295－301.