Aβ誘導大鼠行為學障礙中內質網Aβ結合蛋白的表達及二苯乙烯苷的影響

羅紅波， 石向群， 李 蕓， 郭建魁， 張志強， 尹 榕

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種神經系統變性疾病，其主要的病理學特征之一是腦組織中出現大量老年斑［1］。β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-peptide，Aβ)是老年斑的主要成分，Aβ的神經毒性是AD形成和發展的關鍵因素，其誘發的神經元變性和凋亡與AD患者認知功能、行為學障礙密切相關;Aβ的神經毒性可造成內質網功能障礙，未折疊蛋白或者錯誤折疊的蛋白堆積于內質網，使蛋白質無法與輸送機制耦聯，從而引發疾?。?］。

AD患者的學習記憶及工作能力的逐漸喪失給家庭及社會帶來沉重的負擔，但目前其治療尚無十分有效方法與藥物。研究顯示何首烏的主要有效成分之一(2，3，5，4-四羥基二苯乙烯-2-0-β-D 葡萄糖苷;2，3，5，4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside，二苯乙烯苷，TSG)能減少β-淀粉樣肽誘導的老年斑沉積，改善癡呆模型大鼠學習記憶能力，降低淀粉樣前體蛋白的表達水平［3］。本實驗通過建立AD動物模型，研究在Aβ1-42誘導大鼠學習記憶障礙發生發展中海馬神經元內質網Aβ結合蛋白(endoplasmic re-ticulum amyloid-β peptide-binding protein，ERAB)表達水平的變化及其在介導內質網未折疊蛋白通路中的作用，同時揭示何首烏提取物二苯乙烯苷治療AD的主要作用機制及藥物靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物分組 選用健康4月齡Wistar大鼠80只(中南大學實驗動物中心提供)，雌雄各半，體重250～350g。將選擇好的動物應用隨機數字表進行分組，分為對照組、假手術組、模型組、TSG組各20只。

1.1.2 主要試劑和藥 ERAB一抗購于Stressgen公司;Aβ1-42購于Santa Cruz公司;二苯乙烯苷為從何首烏中提取分離的干粉，含量為68%(湖南中醫藥研究所提供)，實驗時用水溶解為100mg/kg的濃縮液。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型的建立、取材及干預 水合氯醛按2.5ml/kg腹腔麻醉，立體定向儀下固定頭部，參考大鼠圖譜，確定前囟后3.0mm、中線旁2.5mm為海馬所在部位，鉆破顱骨，微量注射器進針約2.9 mm，左右兩側各緩慢均勻注入Aβ1-42各5μg，術后縫合皮膚。假手術組:注射液為等量生理鹽水，灌胃液為生理鹽水;模型組:注射液為Aβ1-42，灌胃液為生理鹽水;二苯乙烯苷(TSG)組:注射液為Aβ1-42，灌胃液為二苯乙烯苷懸液。各組于制模21d取材，以上各組動物于造模前3d開始給藥，每天灌胃一次，動物灌胃量按5ml/kg計算。

1.2.2 行為學檢測 (1)Morris水迷宮定位航行實驗(place navigation test，PNT)每天 8:00～11:00之間對每只大鼠進行訓練，不選平臺所在象限作為入水點，按順時針方向把大鼠面向池壁放入水中，檢測大鼠隱匿平臺潛伏期。如果在規定的最長時間120s內未到達平臺，則由實驗者將其引至平臺，逃避潛伏期記為120s，大鼠在平臺休息20s后進行下一次測試。觀察并記錄動物找到并爬上平臺的潛伏期、游泳路程及游泳軌跡。3d訓練結束后將大鼠按組別進行造模。于制模后21d進行PNT。(2)Morris水迷宮空間探索試驗(spatial probe test，SPT)各組大鼠最后一次PNT后撤除平臺，將大鼠從最后一次入水點面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宮中連續游泳，記錄大鼠120s內穿越原平臺平面的次數。

1.2.3 免疫組織化學法 采用SABC法。切片加3%H2O2，孵育10min，10%山羊血清封閉，孵育10min，滴加兔抗鼠ERAB抗體，4℃冰箱過夜，滴加適量生物素標記羊抗兔二抗工作液，37℃孵育20min，滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15min。DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察，細胞漿中出現棕黃色顆粒者為ERAB陽性細胞。陰性對照取PBS代替一抗，免疫反應陰性，說明一抗的特異性較強。

1.2.4 免疫印跡法(Western blot) 密度梯度離心法提取內質網蛋白，將海馬組織轉移到勻漿器中，加裂解液勻漿，離心(2400r/min，10min)，取上清，繼續離心(轉速12000r/min，15min)，取上清，再離心(15000r/min，30min)，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度;樣品與等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸變性，用10%SDS-PAGE分離，轉移蛋白至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，與一抗孵育，加入辣根過氧化物酶標記二抗孵育，ECL試劑盒進行化學發光檢測，JS-300凝膠圖像儀掃描分析處理

1.3 統計學分析 數據用SPSS12.0軟件處理。計量資料用以均數±標準差(χ±s)表示，兩組間比較用t檢驗，多組獨立樣本比較用方差分析。

2 結果

2.1 Morris水迷宮檢測 與對照組相比，模型組和TSG組大鼠造模后21d的Morris水迷宮測試游泳潛伏期及路程均增加(P＜0.01)，穿越平臺次數下降明顯(P＞0.05)，差別隨時間的延長而加大，以21d差別最明顯(P＜0.01);與模型組比較，TSG組21d的潛伏期縮短(P＜0.05)，游泳路程縮短(P＜0.05)，穿越平臺次數增加(P ＜0.05)，差異具有統計學意義。假手術組與對照組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，排除手術因素干擾(見表1)。

2.2 海馬CA1區ERAB蛋白免疫陽性細胞半定量分析 光鏡下ERAB陽性反應物位于神經元胞漿內，呈棕黃色顆粒狀。結果顯示模型組大鼠海馬CA1區ERAB陽性神經元數目明顯多于對照組和TSG組，差異具有顯著性(P＜0.05)。與對照相比，TSG組可見較多胞漿呈棕黃色顆粒狀的陽性細胞，陽性細胞數明顯減少，有顯著差異性(P＜0.05)。平均灰度值與ERAB陽性細胞數成反比。與對照組比較，模型組大鼠可見ERAB表達的陽性神經元多，平均灰度值明顯減少，有顯著差異性(P＜0.01)。與模型組比較，TSG組ERAB陽性反應產物減少，其平均灰度值增加，差異有統計學意義(P＜0.05)(見表2、見圖1～圖3)。

2.3 內質網Aβ結合蛋白的表達 將產物采用蛋白質印跡方法分析，與對照組比較，可見模型組的ERAB蛋白的表達21d升高，蛋白表達為對照組的109.6%，與模型組比較，TSG組在21d時ERAB蛋白表達減少，統計學比較有顯著性差異(t=16.4317，P=0.00 ＜0.05);假手術組與對照組比較無顯著性差異(t=1.3587，P=0.2041 ＞0.05)，排除手術因素干擾(見表3)。χ±s)

表1 各組大鼠Morris水迷宮行為學比較(χ±s)

表2 海馬CA1區ERAB免疫陽性細胞計數比較(χ±s)

表3 ERAB的蛋白相對表達(ERAB/β-actin)(

3 討論

老年斑是AD的主要組織病理變化，而Aβ是老年斑的主要成分，因此，Aβ的神經毒性是AD形成和發展的關鍵因素。Aβ由39～43個氨基酸組成，來源于淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)，如果各種危險因素導致APP的異常剪切，Aβ的空間構象發生改變，就會導致Aβ異常聚集而產生神經毒性作用［4］。

Aβ的構象折疊主要是在細胞的內質網中完成。內質網是蛋白質合成、加工和轉運的主要場所，在真核細胞的生長發育中起著關鍵作用。內質網腔內有大量的“分子伴侶”，輔助和監控蛋白質的正確折疊并裝配成天然構象。在某些刺激因素下，內質網的功能受到影響，造成大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質堆積，由此引起一系列“分子伴侶”表達上調，以幫助蛋白進一步正確折疊、裝配，使受損細胞在應激情況下存活，這個應答過程稱為內質網應激。ERAB是一個細胞內與Aβ結合的蛋白，是內質網發現的一種羥基類固醇脫氫酶，由262個氨基酸組成［5］。在肝臟和心臟具有最高轉錄活性，正常腦神經元中呈低水平表達，但在AD腦中特別是在Aβ沉積的臨近部位表達量明顯增加［6］。當在AD的神經損傷時，ERAB過度表達，Aβ可與其結合，形成具有神經毒性作用的ERAB-Aβ復合物［7］。由于ERAB缺少信號蛋白和轉膜序列，因此Aβ1-42與ERAB結合后可導致復合物再分布，從內質網轉位至漿膜。研究表明體外抗ERAB抗體可減輕神經元氧化功能減退和細胞凋亡［8］。同樣的，當由于各種因素造成內質網應激的發生的時候，由于未折疊或者錯誤折疊的Aβ堆積，ERAB就可以與之結合，并產生一定的神經毒性作用，ERAB的表達基本與Aβ的生成量成正比關系，因此我們的實驗也從一個側面來反映出模型大鼠的海馬神經元中有內質網應激的形成，在這個形成過程中有包括Aβ等蛋白的大量錯誤折疊，從而導致ERAB的表達發生變化。因此，Aβ1-42神經毒性誘發神經元內質網功能障礙，從而加劇內質網種蛋白錯誤折疊的幾率，使細胞內Aβ的異常剪切增多并積聚，ERAB的表達增多，并于Aβ形成的復合物，這種具有神經毒性的復合物加重了細胞的損傷，并可能誘導凋亡和自嗜發生。

圖1 對照組×400倍

圖2 模型組×400倍

圖3 TSG組×400倍

本實驗中，ERAB免疫反應陽性細胞數及蛋白表達在模型組均較對照組增加。由于ERAB抗體僅與 AβC 端(Aβ1-40和 Aβ1-42)反應，而不與 Aβ1-39和APP全長結合，故該實驗結果可反映出異常折疊的Aβ表達。Aβ是APP分子經BACE和γ-分泌酶共同酶切的產物，ERAB免疫反應陽性神經元在模型組明顯增加，此結果與AD患者腦中ERAB表達和活性增高的有關報道一致。以此推斷AD腦內存在的ERAB產生過多，可能與腦老化過程有關。我們的實驗結果說明Aβ及ERAB表達水平在AD腦病動物海馬神經元中明顯增加，因此，ERAB增加可能是AD海馬神經元退變的機制之一。

我們前期對何首烏提取物TSG的研究表明，TSG能改善AD模型大鼠學習記憶能力，緩解內質網應激的程度，減少自嗜和凋亡［7～11］。因此，本研究進一步揭示TSG治療AD的主要作用機制及藥物靶點。Morris水迷宮實驗中，PNT主要考察大鼠的空間分辨學習能力，SPT主要測量大鼠的工作記憶能力，通過本實驗可以看出，在Aβ毒性作用下，模型大鼠的學習記憶、空間定向、工作記憶能力明顯下降，表現為Y電迷宮躲避所需的電刺激次數增加，Morris水迷宮測試中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺次數減少;說明Aβ對大鼠的學習記憶、空間記憶及工作記憶能力有明顯的損害效應;經TSG干預后，大鼠潛伏期縮短，游泳路程縮短，穿越平臺次數增加，說明TSG可改善模型大鼠空間定向、工作學習能力，具有腦保護作用。Western的結果顯示，經TSG干預后，ERAB的表達明顯降低，結合前期研究說明TSG可通過降低過度的內質網應激程度，減少內質網中錯誤折疊的Aβ，從而逆轉模型鼠海馬神經元中ERAB蛋白的異常上調，提示內質網中的Aβ的產生過程是可以調節的，具有神經保護作用的TSG可通過內質網途徑，減少ERAB、Aβ及其復合物的生成，從而起到改善AD鼠行為學障礙的腦保護作用。

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