腦活素對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的實驗研究

柴子佳， 陳 浩， 范雪麗， 江新梅

周圍神經(jīng)損傷(PNI)是神經(jīng)內(nèi)科常見病的主要臨床表現(xiàn)及相關(guān)臨床伴隨癥狀。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)與周圍靶器官的聯(lián)系需要通過周圍神經(jīng)系統(tǒng)，其傳遞的主要內(nèi)容是感覺和運(yùn)動信號。周圍神經(jīng)損傷發(fā)生率較高，損傷修復(fù)時間較長，很多情況下會造成遠(yuǎn)端器官不可逆的組織萎縮及功能廢用，這不僅導(dǎo)致患者運(yùn)動功能缺失及感覺異常，同時也會造成心理上的痛苦。因此，PNI很大程度上影響患者的生活質(zhì)量，同時在社會經(jīng)濟(jì)學(xué)上影響深遠(yuǎn)［1］。積極尋找一種可促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)的方法迫在眉睫。

Wei ZH［2］等人通過大量數(shù)據(jù)總結(jié)出腦活素對治療癡呆和卒中后遺癥有很好的療效，甚至對輕至中度的認(rèn)知障礙患者具有增強(qiáng)記憶的作用。近年來對于腦活素治療周圍神經(jīng)病的研究日益火熱，付睿等人［3］使用腦活素治療急性特發(fā)性面神經(jīng)麻痹已在臨床上取得很好的治療效果，尤其在對于House-Brackmann分級Ⅴ～Ⅵ級重癥患者使用施普善的總有效率可達(dá)82.4%;Sherifa［4］應(yīng)用腦活素對 6種傳統(tǒng)治療方法不能解決的周圍神經(jīng)損傷進(jìn)行治療，均取得了很好療效。本文將以鼠坐骨神經(jīng)損傷模型判定腦活素對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試藥 施普善 奧地利艾威特藥品有限公司10ml:2152mg;甲鈷胺:日本衛(wèi)材株式會制造 1ml:0.5mg。

1.1.2 動物及分組 雌性Wistar成年大鼠，體重180～200g，實驗動物均由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。動物隨機(jī)分為5組，分別為生理鹽水空白對照組(A組)、甲鈷胺陽性藥物對照組(B組)、腦活素低劑量組(C組)、腦活素中劑量組(D組)及腦活素高劑量組(E組)，每組10只。A組每天給予2ml生理鹽水腹腔注射，余4組根據(jù)體表面積計算公式，按照人類用量換算相應(yīng)大鼠藥物劑量;B組每天給予甲鈷胺0.21ml/kg(約為成人500μg/d)配成2ml腹腔注射;C組每天給予施普善低劑量1.04ml/kg(約為成人10ml/d)配成2ml腹腔注射;D組每天給予施普善中劑量組3.12ml/kg(約為成人30ml/d)配成2ml腹腔注射;E組每天給予施普善高劑量組5.2ml/kg(約為成人50ml/d)配成2ml腹腔注射。用藥為一個療程，共計10d。

1.2 方法

1.2.1 制備模型方法 實驗動物以10%水合氯醛(0.1ml/kg)作腹腔注射麻醉。以俯臥位固定于鼠板上，右側(cè)臀部備皮處理后，用碘伏在備皮處進(jìn)行消毒，共3次。無菌條件下作右臀部斜切口，于臀肌間隙鈍性分離顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣0.5cm處使用14cm止血鉗鉗夾坐骨神經(jīng)，寬度約為1.5mm，單次鉗夾 10s，間隔 5s，共鉗夾 3 次，用 4-0慕絲手術(shù)縫線在鉗夾處旁邊的肌肉縫線標(biāo)記，之后立即以4-0慕斯手術(shù)縫線，縫合切口。

1.2.2 一般狀態(tài) 分別于術(shù)后24h及取材前觀察各組大鼠的毛色、狀態(tài)及整體活動情況。

1.2.3 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)評分 自制大鼠足行走箱，通道長90cm，寬15cm，高20cm。箱底放置連續(xù)記錄紙(15cm寬)。受試鼠雙后足蘸炭素墨水，放入行走箱入口，鼠在向遠(yuǎn)端爬行過程中每側(cè)留4～5個足印，選實驗側(cè)足(E)和正常側(cè)足(N)足印，測量以下3個變量。(1)足印長度 (print length，PL)，指足印最長距離，即足跟到足尖的距離;(2)足趾寬度 (toe spread，TS)，即第一趾到第五趾連線的距離;(3)中間足趾距離(inter toe distance，IT)，即第二趾到第四趾連線的距離。將上述3個變量代入Bain公式計算SFI，以SFI=0為正常值，-100為神經(jīng)完全斷離指標(biāo)。SFI=-38.3*(EPL-NPL)/NPL+109.5*(ETS-NTS)/NTS+13.3*(EIT-NIT)/NIT-8.8 于制備模型24h 后及取材前兩次測量記錄

1.2.4 斜坡實驗 自制長60cm，寬30cm，高60cm玻璃水槽，內(nèi)置可勻速改變斜坡，表面為磨砂膠板，將一個療程后實驗大鼠放置在膠板中央，勻速改變膠板坡度，待實驗側(cè)后肢下滑長度達(dá)于5cm時，記錄膠板傾斜角度，共實驗3次取平均值。

1.2.5 小腿三頭肌濕重 緊貼骨面取出兩側(cè)小腿三頭肌，剔除表面結(jié)締組織，濾紙吸干表面血液后，即刻在電子分析天平上稱重，并和自身健側(cè)小腿三頭肌濕重比較。

1.2.6 坐骨神經(jīng)取材方法 實驗動物以10%水合氯醛(0.1ml/kg)作腹腔注射麻醉。以俯臥位固定于鼠板上，右側(cè)臀部進(jìn)行備皮處理，完成備皮后，用碘伏在備皮處進(jìn)行消毒，共3次。無菌條件下沿原切口切開，鈍性分離股間肌后顯露坐骨神經(jīng)，于慕絲線標(biāo)記處及其遠(yuǎn)端10mm進(jìn)行取材，要使用鋒利組織剪刀剪斷神經(jīng)，再用剃須刀片行逆向平行切割遠(yuǎn)側(cè)斷端，近側(cè)斷端斜行切割，利于辨別，隨即放入3%戊二醛中固定。

1.2.7 甲苯胺藍(lán)神經(jīng)染色 取材后的神經(jīng)塊可放入3%的戊二醛固定(4℃)，之后加1%的鋨酸進(jìn)行后固定2h，常規(guī)脫水、包埋、制成病理標(biāo)本。使用Leica半薄切片機(jī)切片，厚度為1μm，最后使用現(xiàn)用現(xiàn)配的甲苯胺藍(lán)染色劑進(jìn)行滴染，滴2～3滴至載玻片的神經(jīng)切片上，酒精燈微加熱至略干即可。

1.2.8 有髓神經(jīng)纖維計數(shù) 將制備好的甲苯胺藍(lán)染色標(biāo)本使用olympus BX51顯微鏡及cell Sens Dimension細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察照相，10倍1張，20倍2張，隨機(jī)不重疊40倍視野4張。使用iP-win32醫(yī)學(xué)圖像計量軟件對有髓神經(jīng)纖維進(jìn)行測量，以獲得數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過圖像分析和計算，得出坐骨神經(jīng)直徑、周長及面積變化情況，取其平均值。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 所得計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS18.0軟件，單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，其中實驗組間兩兩比較采用Bonferroni法，與對照組比較采用Dunnett法統(tǒng)計。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài) 進(jìn)行模型制備24h后進(jìn)行觀察，各組大鼠精神狀態(tài)尚可，可自主進(jìn)食，有趨避活動。在實驗過程中，A組1只大鼠實驗過程中死亡，1只手術(shù)切口感染，1只取材時麻醉致死;B組1只手術(shù)切口感染;C、D、E組無切口感染及死亡。

2.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù) 模型制備成功后24h測量各組坐骨神經(jīng)指數(shù)無差異性，表示損傷程度一致。用藥一個療程后，用藥組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)均好于空白對照組，其中D、E組與A組比較差異具有顯著性(分別為 P＜0.05，P＜0.01)。用藥各組間比較E組與B、C組比較差異具有顯著性(P ＜0.05)，余未見顯著性(見表1)。

2.3 斜坡實驗 未用藥組角度小于各用藥組，A 組54.28 ±1.75 與 C 組58.86 ±2.47、D 組59.00 ±4.11、E 組 61.52 ±5.53 各組差異有顯著性(P ＜0.05、P ＜0.05、P ＜0.01)。在各用藥組間對比中，E組較B 組56.62±2.47差異具有顯著性(P ＜0.05)。

2.4 有髓神經(jīng)纖維計數(shù) 用藥組較未用藥組的有髓纖維粗且明顯，腦活素的改變隨劑量增加而明顯。B、C、D、E組均與A組有顯著的差異(P＜0.01)，用藥組之間對比，E組效果較好，均與B組對比結(jié)果具有差異性，尤其在平均直徑和面積具有顯著差異(P＜0.01)(見表2)。

2.5 小腿三頭肌肌肉濕重 僅E組0.454±0.11與 A 組 0.614±0.11間具有差異性(P ＜0.05)，余4組間比較無差異性。

表1 各組坐骨神經(jīng)指數(shù)

表2 各組有髓神經(jīng)纖維測量

3 討論

160 年前，Waller A［5］描述了青蛙的舌咽神經(jīng)及舌下神經(jīng)損傷后其橫截面的形態(tài)學(xué)改變，后人便將此種改變稱為瓦勒變性，并經(jīng)過不斷探索，總結(jié)了周圍神經(jīng)損壞修復(fù)途徑及其機(jī)制-瓦勒變性及軸索再生。受傷的外周軸索有再生能力，但其再生的速度較慢且功能恢復(fù)較差，其中一個重要原因就是隨著時間推遲周圍組織的神經(jīng)營養(yǎng)因子減少［6］，所以促進(jìn)再生的治療方法主要是應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子。最值得說明的一點(diǎn)是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)已被證明可提高神經(jīng)損傷處的軸索遠(yuǎn)端再生能力［7］，無論是其來源于施旺細(xì)胞還是運(yùn)動神經(jīng)元［8］。周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)不僅與神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)，同時還與炎癥反應(yīng)有關(guān)，Andrew D［9］等人提出及時的調(diào)節(jié)損傷處的炎癥細(xì)胞，有助于保護(hù)周圍神經(jīng)再生相關(guān)細(xì)胞，從而可促進(jìn)周圍神經(jīng)的修復(fù)。

腦活素是用生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的酶學(xué)降解法對純化的豬腦蛋白進(jìn)行提取加工的一種肽制劑。腦活素具有BDNF的大多數(shù)作用。經(jīng)過對比研究表明腦活素對于減少神經(jīng)變性及促進(jìn)神經(jīng)損傷后的軸索再生作用要優(yōu)于BDNF［10］。長期的研究發(fā)現(xiàn)一些短肽及神經(jīng)營養(yǎng)素活性物類似于睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，膠質(zhì)增生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，和胰島素樣生長因子-1和-2(IGF-1和IGF-2)存在于腦活素中，這些均參與了神經(jīng)營養(yǎng)的作用［11］。在最新的研究中，Kiren Ubhi等人通過hAPP轉(zhuǎn)基因小鼠實驗中已經(jīng)證明了腦活素參與了NGF前體蛋白轉(zhuǎn)化成NGF的過程并保持兩者的平衡。同時腦活素具有一些額外的抗氧化及抗炎功能，這也許對周圍神經(jīng)的修復(fù)起到另一種關(guān)鍵作用。

本實驗研究證明腦活素對周圍神經(jīng)的修復(fù)作用具有量效關(guān)系，并且高劑量組明顯好于甲鈷胺組及腦活素低、中劑量組。此次實驗為周圍神經(jīng)的修復(fù)找到了新的治療方法，也為腦活素治療周圍神經(jīng)提供了科學(xué)依據(jù)，但是施普善作用于周圍神經(jīng)的修復(fù)機(jī)制還尚不清楚，仍為值得探討研究的方向。

［1］Taylor RS.Epidemiology of refractory neuropathic pain［J］.Pain Pract，2006，6，22-26.

［2］Wei ZH，He QB，Wang H，et al.Meta-analysis:the efficacy of nootropic agent cerebrolysin in the treatment of Alzheimer’s disease［J］.Neural Transm，2007，114:629-634.

［3］付 睿，戴 威，孟 然等.腦蛋白水解物治療急性特發(fā)性面神經(jīng)麻痹隨機(jī)對照研究［J］.Chin JNerv Ment Dis，2011，37(5):295-297.

［4］Sherifa AH.Cerebrolysin as a nerve growth factor for treatment of acquired peripheral nervous system diseases［J］.Neural Regen Res，2011，6(18):1415-1420.

［5］Waller A.Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog，and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibres［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society of London，1850，140:423-429.

［6］Gordon T.The role of neurotrophic factors in nerve regeneration［J］.Neurosurg Focus，2009，26(2):E3.

［7］English AW，Meador W，Carrasco DI.Neurotrophin-4/5 is required for the early growth of regenerating axons in peripheral nerves［J］.Eur J Neurosci，2005，21:2624-2634.

［8］Jennifer C.Wilhelm，Mei Xu et al.Cooperative roles of BDNF expression in neurons and schwann cells are modulated by exercise to facilitate nerve regeneration［J］.J Neuroscience，2012，32(14):5002-5009.

［9］Andrew DG，Phillip GP，Matt SR.Wallerian degeneration:Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury［J］.J Neuroinflammation，2011，8:110.

［10］Haninec P，Dubovy P，Samal F，et al.Reinnervation of the rat musculocutaneous nerve stump after its direct reconnection with the C5 spinal cord segment by the nerve graft following avulsion of the ventral spinal roots:a comparison of intrathecal administration of brainderived neurotrophic factor and cerebrolysin［J］.Exp Brain Res，2004，159(4):425-432.

［11］Chen H，Tung YC，Li B，et al.Trophic factors counteract elevated FGF-2-induced inhibition of adult neurogenesis［J］.Neurobiol Aging，2007，28:1148-1162.