活血化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞和間隙連接蛋白43的影響※

任 榮 孫玉鳳 郭沛然 何莉莉 張 玉 朱雅娜

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)是糖尿病(diabetic melliutus，DM)常見的一種慢性并發(fā)癥，主要特點(diǎn)為胃動(dòng)力障礙、胃排空延遲，臨床發(fā)病率約為50%[1]。 Kassander等[2]于1958年首先提出“糖尿病胃輕癱”這一概念并描述了其癥狀，常見癥狀包括早飽、惡心、腹脹、嘔吐、食欲不振，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，并可影響血糖的調(diào)控，引起營(yíng)養(yǎng)不良和水電解質(zhì)紊亂[3]。 DGP的發(fā)病具有復(fù)雜的病因、病理特點(diǎn)，目前為止，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，尚無(wú)良好的治療藥物方法。前期研究證實(shí)活血化瘀通絡(luò)中藥組方丹參、川芎、水蛭、地龍能明顯改善糖尿病胃輕癱的胃排空率[4]。本研究通過活血化瘀通絡(luò)中藥對(duì)胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)和間隙連接蛋白43(Cx43)的影響，進(jìn)一步探討其治療作用及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、儀器及試劑

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specefic pathogen Free，SPF)級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量(250±20)g。河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)：1112061)，飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心潔凈實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，晝夜明暗交替時(shí)間12/12 h。

1.1.2 藥物 活血化瘀通絡(luò)中藥由丹參、川芎、水蛭、地龍組成，常規(guī)煎煮2次，水浴加熱蒸發(fā)濃縮為每100 mL溶液含100 g生藥，所用生藥由河北省中醫(yī)院中藥房提供。

1.1.3 試劑 兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體(美國(guó)Bioworld生物公司) 試劑盒；兔抗大鼠Cx43多克隆抗體(美國(guó)Bioworld生物公司) 試劑盒。

1.1.4 儀器 Horizon快速血糖儀[強(qiáng)生(中國(guó))有限公司]；CMIS2011骨髓細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(重慶海天醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.2 動(dòng)物模型制備[5]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥1組(丹參、川芎組)、中藥2組(水蛭、地龍組)、中藥3組(丹參、川芎與水蛭、地龍合方組)。造模前禁食12 h，除對(duì)照組外，其余組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，STZ按1%比例以檸檬酸緩沖液稀釋(pH=4.4，冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，劑量為60 mg/kg；對(duì)照組大鼠腹腔注射等容積0.9%氯化鈉注射液。7 d后在非禁食情況下采尾靜脈血，以Horizon快速血糖儀檢測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。

1.3 給藥方法 造模成功后，實(shí)驗(yàn)藥物劑量按體表面積換算，中藥1組、中藥2組、中藥3組大鼠分別給予中藥1.2 g/(kg·d)灌胃，對(duì)照組及模型組給予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日1次(10：00左右)，共6周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法測(cè)定胃肌層組織中c-Kit和Cx43表達(dá)。

1.4.1 取材 給藥6周后，各組大鼠稱質(zhì)量，再禁食16～24 h、禁水2 h后，按2 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射8%異戊巴比妥鈉麻醉后，剖開腹腔，結(jié)扎賁門和幽門，取出整個(gè)鼠胃;部分胃組織先用4%多聚甲醛固定，再漂洗、脫水，石蠟包埋，切片。

1.4.2 染色 按試劑盒規(guī)定程序操作，滴加特異性標(biāo)記ICC的兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體(美國(guó)Bioworld生物公司)和標(biāo)記Cx43的兔抗大鼠Cx43多克隆抗體(美國(guó)Bioworld生物公司)。顯色、復(fù)染、封片，鏡檢。

1.4.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)定胃肌層組織中c-Kit和Cx43表達(dá) 應(yīng)用CMIS2011骨髓細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，C-Kit、Cx43陽(yáng)性表達(dá)水平用平均灰度值表示，灰度值越高其陽(yáng)性表達(dá)水平越低，即細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白含量越低。

2 結(jié) 果

2.1 各組胃肌層組織c-Kit和Cx43表達(dá)

2.1.1 各組胃肌層組織c-Kit的表達(dá) 對(duì)照組c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層和縱形肌層之間，集中于環(huán)形肌內(nèi)及附近；與正常對(duì)照組比較，模型組、中藥各組c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞分布密度明顯減弱(P<0.05)；與模型組比較，中藥各組c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞分布密度增強(qiáng)(P<0.05)；中藥組間比較，中藥3組較其他2組c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞分布密度增強(qiáng)(P<0.05)。見表1。

2.1.2 各組胃肌層組織Cx43的表達(dá) 正常對(duì)照組Cx43陽(yáng)性表達(dá)密集分布在胃體和胃竇部環(huán)形肌層中，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)弱與c-Kit陽(yáng)性表達(dá)分布具有一致性；與正常對(duì)照組比較，模型組、中藥各組Cx43的表達(dá)明顯減低(P<0.05)；與模型組比較，中藥各組Cx43的表達(dá)升高(P<0.05)；中藥組間比較，中藥3組較其他2組Cx43的表達(dá)升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組胃肌層組織c-kit和Cx43灰度值比較

與正常對(duì)照組比較，△P

3 討 論

DGP是DM常見的慢性并發(fā)癥，是以胃動(dòng)力下降、胃排空延遲、胃節(jié)律紊亂等為主要特點(diǎn)的一系列臨床癥候群，表現(xiàn)為上腹部飽脹、惡心、嘔吐和全身癥狀等。上世紀(jì)四十年代有研究首先報(bào)道了糖尿病并發(fā)癥和胃排空延遲之間的關(guān)系，證實(shí)糖尿病患者50%以上伴有糖尿病胃輕癱[6]。目前糖尿病胃輕癱的發(fā)病機(jī)制并不明確，認(rèn)為與以下幾方面因素有關(guān)：①自主神經(jīng)及內(nèi)在神經(jīng)病變；②高血糖；③胃腸激素變化； ④ 微血管及胃腸平滑肌病變； ⑤ICC病變[7]。過去一直認(rèn)為，自主神經(jīng)病變是糖尿病胃輕癱的重要發(fā)病機(jī)制，而近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)它不能解釋糖尿病胃輕癱通常伴有的胃電起搏功能受損的改變，這種電起搏活動(dòng)并不依賴腸神經(jīng)或自主神經(jīng)信號(hào)的輸入[8]。ICC是一種存在于胃腸道的特殊細(xì)胞，是胃腸道的起搏細(xì)胞，能自發(fā)產(chǎn)生慢波，慢波決定胃腸平滑肌收縮的節(jié)律，是胃腸運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)[9]。ICC 是胃腸道中惟一表達(dá)c-Kit的細(xì)胞，糖尿病胃輕癱患者胃ICC的c-kit mRNA表達(dá)量減少，導(dǎo)致c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞在胃體和胃竇部環(huán)形肌層和縱形肌層之間分布密度明顯減弱，從而影響ICC正常生物學(xué)功能，結(jié)構(gòu)破壞、數(shù)量減少，最終發(fā)生胃腸電活動(dòng)紊亂和胃腸運(yùn)動(dòng)障礙等。縫隙連接，又稱間隙連接、通訊連接，是相鄰2個(gè)細(xì)胞之間的一種特殊膜結(jié)構(gòu)[10]，由位于相鄰細(xì)胞膜上的2個(gè)連接子構(gòu)成，其蛋白成分稱為連接蛋白。縫隙連接蛋白(Cx)是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接(GJ)通道的基本結(jié)構(gòu)和功能蛋白。Cx43在Cx家族中分布較為廣泛，是構(gòu)成GJ最重要組成成分[11]。相鄰細(xì)胞間通過間隙連接所介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接通訊進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換，對(duì)細(xì)胞間信息調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程起著重要的作用[12]。Nemeth等[13]研究顯示，Cx43在ICC胞體和細(xì)胞突起上表達(dá)，從而證實(shí)ICC彼此及與平滑肌細(xì)胞之間形成間隙連接。消化道平滑肌細(xì)胞的收縮與松弛是膜電位周期性去極化和復(fù)極化的結(jié)果，間隙連接正是傳導(dǎo)細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)勢(shì)能的部位。所有組織細(xì)胞間動(dòng)作電位的擴(kuò)布和傳播通過間隙連接完成，因此它是電活動(dòng)和代謝反應(yīng)的偶聯(lián)點(diǎn)[14]。DGP患者存在ICC網(wǎng)絡(luò)的異常、超微結(jié)構(gòu)的損傷及其與神經(jīng)末梢及平滑肌之間縫隙連接的減少。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為久病入絡(luò)，導(dǎo)致絡(luò)脈瘀滯，血行不暢。我們認(rèn)為DGP的基本病機(jī)為氣血阻于胃絡(luò)，氣血阻滯不暢，導(dǎo)致胃運(yùn)化不利，進(jìn)而發(fā)生胃輕癱。中藥丹參涼血養(yǎng)血活血，川芎行氣活血，水蛭、地龍具有通絡(luò)作用，在臨床中應(yīng)用丹參、川芎、水蛭、地龍活血化瘀通絡(luò)復(fù)方治療DGP取得良好療效，本研究通過應(yīng)用活血化瘀通絡(luò)復(fù)方及其拆方中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察其對(duì)DGP大鼠胃c-Kit和Cx43表達(dá)的影響，結(jié)果表明，DGP大鼠存在胃c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞和Cx43表達(dá)減低；中藥各組方治療后可明顯提高c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞和Cx43的陽(yáng)性表達(dá)，中藥活血化瘀通絡(luò)復(fù)方優(yōu)于單純的活血方和通絡(luò)方。提示活血化瘀通絡(luò)復(fù)方及其拆方中藥對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠的作用，可能與上調(diào)間隙連接蛋白基因表達(dá)和改善細(xì)胞間隙連接通訊功能有關(guān)。

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