4種滋陰藥含藥血清的免疫調節作用的比較研究*

★賴小東 趙益 尚廣彬 徐國良 孫有智（江西中醫學院 南昌 330004）

臨床上治療腫瘤的方法雖然各不相同，但滋陰清熱是其中最為常用的治療方法之一。滋陰藥可以提高機體的免疫功能來達到抗腫瘤的作用，例如六味地黃湯、山藥、墨旱蓮、枸杞子能提高免疫功能[1-6]。本實驗選擇了4種常用的滋陰方：六味地黃丸、二至湯、二冬膏、一貫煎，考察他們對大鼠免疫功能的影響以及分泌IL-2的作用，比較其提高免疫的強弱，為研究抗腫瘤效應提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠，雄性，體重180±20g，由江西中醫學院實驗動物中心提供。批號：SCXK（贛）2005-0001。

1.2 實驗藥品

天冬、麥冬、女貞子、墨旱蓮、北沙參、麥冬、當歸、生地、枸杞子、川楝子，均購于北京同仁堂藥店；六味地黃丸水蜜丸（北京同仁堂藥店，批號：1004701）。

二冬湯：精密稱取天冬200g、麥冬200g，第一次加入8倍量的水煎煮3小時，第二次加入6倍量的水煎煮2小時，合并濾液，過濾，濾液濃縮，密度為2g/mL。

六味地黃丸：稱取六味地黃丸300g，加雙蒸水研磨至密度為2g/mL。

二至湯：稱取女貞子200g、墨旱蓮200g，第一次加入8倍量的水煎煮3小時，第二次加入6倍量的水煎煮2小時，合并濾液，過濾，濾液濃縮，密度為2g/mL。

一貫煎：稱取北沙參161g，麥冬161g，當歸161g，生地483g，枸杞子193.2g，川楝子80.5g。第一次加入8倍量的水煎煮3小時，第二次加入6倍量的水煎煮2小時，合并濾液，過濾，濾液濃縮，密度為2 g/m L。

1.3 主要試劑與儀器

刀豆蛋白A：Sigma公司（批號：20110918）；脂多糖：Sigma公司（批號：20110926）；大鼠白細胞介素IL-2試劑盒：上海西塘生物科技有限公司；

1.4 動物分組與含藥血清制備

清潔級SD大鼠30只，普通環境，自然光照，自由飲水、普通飼料，室溫20±2℃，適應性飼養三天后，按體重隨機分為兩組：空白對照組、二冬湯組、六味地黃丸組、二至湯組、一貫煎組，每組6只。根據預實驗，確定給藥劑量為二冬湯7.99g/kg/天，六味地黃丸4.8g/kg/天，二至湯6.77g/kg/天，一貫煎15.4 g/kg/天，每天分2次以灌胃方式給藥，給藥5天后，取血，放在25℃室溫下靜置1小時，凝血后2 000rpm離心20分鐘，取上清液，并將同一組大鼠的血清合并，56℃滅活30分鐘，然后用0.22μm醋酸纖維素膜過濾，4℃保存備用。

1.5 大鼠脾淋巴細胞的制備

無菌條件下剖開雄性SD大鼠腹腔取脾，用生理鹽水沖洗干凈，在100目篩網上一邊研磨一邊用Hank＇s液沖洗，收集分離所得的脾細胞懸液，1 000r/分離心5分鐘，吸棄上清；添加紅細胞裂解液10mL，混勻脾細胞，靜置4-5分鐘，待紅細胞完全破碎后，1 000r/分離心5分鐘，吸棄上清剔除紅細胞，Hank＇s液沖洗3遍，用RPMI1640培養液重懸細胞，計數，調整脾細胞濃度為1×108個/mL。

1.6 4種含藥血清對ConA誘導的T淋巴細胞增殖的影響

在96孔培養板中分別加入含藥血清使終濃度為10%，20%，每個濃度組分別設相應濃度的空白對照組血清最為對照組。每組設3個復孔，另外設置一個不含血清組對照，每孔中加入1×108個/mL細胞懸液100μL，100μg/mL的ConA，使終濃度為10 μg/mL，將培養板置5%的CO2培養箱飽和濕度37℃培養72小時。于培養結束前4小時，加入5mg/mL的MTT溶液20μL，置37℃5%CO2培養箱中繼續培養4小時。取出培養板，每孔加入200μL二甲基亞砜（DMSO），靜置20分鐘，使紫色結晶呈完全溶解。，以無細胞懸液孔調零，490nm處使用酶標儀測OD值。

1.7 4種含藥血清對LPS誘導的B淋巴細胞活性檢測

在96孔培養板每孔中分別加入含藥血清使終濃度為10%，20%，每個濃度組分別設相應濃度的空白血清組對照。每組設3個復孔，每孔中加入1×108個/mL細胞懸液100μL，100μg/mL的LPS使終濃度為5μg/mL，將培養板置5%的CO2培養箱飽和濕度37℃培養72小時。于培養結束前4小時，加入5mg/mL的MTT溶液10μL，置37℃5%CO2培養箱中繼續培養4小時。取出培養板，每孔加入200μL二甲基亞砜（DMSO），靜置20分鐘，使紫色結晶呈完全溶解。，以無細胞懸液孔調零，490nm處使用酶標儀檢測OD值。

1.8 4種含藥血清對ConA/LPS誘導脾淋巴細胞分泌IL-2的影響

用24孔培養板，每孔加入1×108個/mL脾細胞懸液1mL，并加入100μg/mL的ConA/LPS溶液，使終濃度為10/5μg/mL，根據前期研究結果，確定含藥血清加入量為10%，空白血清組加入相應的空白血清血清，將培養板置37℃，5%CO2培養箱中，培養48h后，離心，沉淀，取上清液，備用。

1.9 統計學分析

采用SPSS12.0分析軟件對數據進行方差分析，結果用（±s）表示，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 4種含藥血清對ConA/LPS誘導的大鼠淋巴細胞增殖的影響

見表1、2。

表1 4種含藥血清對ConA誘導的大鼠T淋巴細胞增殖的影響（n=3，-±s）

表1 4種含藥血清對ConA誘導的大鼠T淋巴細胞增殖的影響（n=3，-±s）

注：與空白血清組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白血清+conA二冬含藥血清+conA六味含藥血清+conA二至含藥血清+conA一貫煎含藥血清+conA含藥血清濃度10%0.157±0.019 0.258±0.024**0.272±0.041**0.256±0.015**0.217±0.013*20%0.147±0.024 0.286±0.020**0.242±0.045*0.251±0.026**0.210±0.018*

表2 4種含藥血清對LPS誘導的B大鼠淋巴細胞增殖的影響（n=3，x-±s）

表1結果表明，二冬湯含藥血清對ConA誘導的T淋巴細胞增殖均具有促進作用，與空白對照組比有極顯著性差異（P＜0.01），且隨給藥濃度的增加其增殖效應也增加，20%濃度的含藥血清對ConA誘導的大鼠脾淋巴細胞的增殖作用最強；六味地黃丸10%濃度、20%濃度的含藥血清都能增加T淋巴細胞的增殖，與空白對照組比有顯著性差異（P＜

0.05 ），其中10%濃度的效果強于20%濃度；二至湯和一貫煎對T淋巴細胞的增殖并未看出隨濃度增加效應增大的趨勢，二至湯組與空白對照組比較有極顯著性差異（P＜0.01），一貫煎組與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表2結果表明，二冬湯含藥血清對LPS誘導的B淋巴細胞的增殖均具有促進作用，與空白對照組比有極顯著性差異（P＜0.01），且隨給藥濃度的增加其增殖效應也增加，20%含藥血清的增殖作用最強；六味地黃丸兩個濃度的含藥血清都能引起B淋巴細胞增殖，與空白對照組比有顯著性差異（P＜0.05）；二至湯兩個濃度之間對B淋巴細胞的增殖無明顯差異，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；一貫煎對B淋巴細胞的增殖隨濃度增加效應增大的趨勢，20%濃度一貫煎組與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 4種含藥血清對ConA/LPS誘導的大鼠脾淋巴細胞分泌IL-2的影響

見表3、4。

表3 4種含藥血清對conA誘導的大鼠T淋巴細胞IL-2的影響（n=3，±s）

表3 4種含藥血清對conA誘導的大鼠T淋巴細胞IL-2的影響（n=3，±s）

注：與空白血清組比較*P＜0.05，**P＜0.01

IL-2(pg/m L)238.24±10.72 378.24±14.38**361.10±35.72**342.0±22.15**319.19±10.53**組別脾+conA+空白血清脾+conA+二冬血清脾+conA+六味血清脾+conA+二至含藥血清脾+conA+一貫煎含藥血清

表4 4種含藥血清對LPS誘導的大鼠B淋巴細胞IL-2的影響（n=3，±s）

表4 4種含藥血清對LPS誘導的大鼠B淋巴細胞IL-2的影響（n=3，±s）

注：與空白血清組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別脾+LPS+空白血清脾+LPS+二冬血清脾+LPS+六味血清脾+LPS+二至血清脾+LPS+一貫煎含藥血清IL-2(pg/m L)150.62±6.75 218.24±10.14**168.71±7.95*183.00±5.71**159.19±6.75

表3、4表明，4種滋陰藥含藥血清可以促進ConA誘導的大鼠脾淋巴細胞分泌白介素-2（IL2），與空白血清組比有極顯著性差異（P＜0.01），其中以二冬膏含藥血清的作用最為明顯。對于LPS誘導的大鼠B淋巴細胞分泌IL-2的作用，二冬含藥血清的作用最為明顯，與空白血清組比有極顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論

中藥抗腫瘤的機理有很多種，其中滋陰藥抗腫瘤的機制主要集中在：抑制細胞增殖、提高機體免疫力、誘導細胞凋亡等，其中提高機體免疫力是一個重要機制。現代醫學認為，機體的免疫功能與腫瘤的發生發展有密切關系。當宿主免疫功能低下或受抑制時，腫瘤發生率增高，而在腫瘤進行性生長時腫瘤患者的免疫功能受抑制，二者也互為因果[7]。因此，如何增強機體免疫功能，更好地發揮機體的抗腫瘤免疫機制，已成為目前腫瘤研究的重要課題之一。縱觀腫瘤的發生發展過程，腫瘤細胞必須克服內在，細胞自主和外在，免疫介導的屏障才能成瘤，宿主的免疫功能是決定腫瘤發生和發展的最后關卡，只有當癌變細胞通過各種免疫逃避機制逃過免疫監視，克服免疫功能的控制，腫瘤才能進展或致死宿主，因此從這一角度講，腫瘤可能是一種免疫學。目前中藥抗腫瘤有扶正固本法、除痰散結法、化積消滯法、清熱解毒法、活血化瘀法、滋陰清熱法等，是現代中藥抗腫瘤的基本療法。藥物集中在：扶正類，如人參、甘草、黃芪、黨參；消積類，如陳皮、莪術、豬苓；還要解毒類，如半枝蓮、仙鶴草、夏枯草、白花蛇舌草[8]。目前臨床上治療腫瘤的方法雖然各不相同，但滋陰清熱是其中最為常用的治療方法之一。臨床以養陰清熱法治療惡性腫瘤，大都可取得提高生存質量，減輕化療毒副反應的效果[9-10]。大量地臨床實踐說明陰虛與癌瘤的發生發展之間存在一定的相互關聯性。對此，我們在分析目前腫瘤發病機制認識的基礎上，結合現代醫學理論，提出了“陰虛癌瘤相關”的新假說，認為滋陰法能改變腫瘤發生的內環境，既可有效預防惡性腫瘤的發生，也能抑制惡性腫瘤的生長[11]。

脾臟擁有全身循環T淋巴細胞的25%，直接參與細胞免疫，并對外周血中T細胞亞群的分布具有重要的調節作用，脾臟對T淋巴細胞免疫的調節作用是腫瘤免疫的一個重要環節，B淋巴細胞約占脾內淋巴細胞總數的55%，在腫瘤抗原刺激下轉化為漿細胞，繼而分泌特異性抗腫瘤的免疫球蛋白IgG，且具有抗原提呈能力[12]。白介素-2（IL-2）是一種在白細胞或者免疫細胞間相互作用的淋巴細胞因子，與血細胞生長因子同屬細胞因子，兩者相互協調、相互作用，共同完成造血和免疫調節功能，并在傳遞信息，激活與調節免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應中起重要作用，同時可以促使T/B淋巴細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）分泌抗體及干擾素，并產生抗病毒、抗腫瘤和增強機體免疫功能等作用[13]。

本從本實驗的結果可見，四種滋陰藥含藥血清都可以促進T、B淋巴細胞的增殖、促進IL-2的分泌，提示滋陰藥主要是通過提高腫瘤細胞的免疫功能達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。

[1]孫學海，安志遠，翁福海.六味地黃丸增強免疫功能的實驗研究[J].天津中醫，1994，14（6）：40.

[2]王彥武，李鳳文，黃超培.墨旱蓮提取物對小鼠免疫調節作用的研究[J].應用預防醫學，2008，14（6）：354-356.

[3]許小華，郝鵬飛，楊云，等.墨旱蓮多糖對正常小鼠的免疫調節作用[J].中國方劑學雜志，2010，16（5）：181-182.

[4]張曉宇.枸杞子抗癌作用及臨床研究概述[J].職業與健康，2007，23（18）：1657-1658.

[5]程林，陳斌，蔡寶昌.山藥及其麩炒品的多糖部位對小鼠免疫功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2006，17（2）：86-89.

[6]趙國華，陳宗道，李志孝，等.山藥多糖對荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].營養學報，2003，25（1）：110-112.

[7]Tsai JP，Chen HW，Cheng ML，et al.Analysis of host versustumor interaction in cancerpatients：opposing role of transforming growth factor-betal and interleukin-6 in the development of in situ tumor immunity[J].Immunobio1，2005，210（9）：661-671.

[8]劉建明，陳素紅，呂圭源.扶正、化積、解毒中藥抗腫瘤作用研究進展[J].亞太傳統醫藥，2011，7（3）：155-156.

[9]朱彩平，張聲華.枸杞多糖對H22肝癌小鼠的抑癌作用[J].中國公共衛生，2006，22（6）：717-71.

[10]徐文清，高文遠，沈秀，等.銀耳孢子多糖抑制腫瘤及放射增效作用的研究[J].中國生化藥物雜志，2006，27（6）：351-354.

[11]孫有智，劉紅寧，朱衛豐，等.“陰虛癌瘤相關”假說的提出及其意義[J].江西中醫學院學報，2008，20（4）：1-5.

[12]謝電，陳耀星，王子旭，等.單色光對脂多糖應激后肉雞脾臟組織結構及脾細胞免疫 功能的影響[J].中國農業大學學報，2007，12（1）：13-16.

[13]肖嘯，楊繼生，李松彪，等，白介素-2對臨床意義的研究[J].山東畜牧醫藥，2008，29（5）：45-46