白芷醇提液中總黃酮測(cè)定方法的比較研究

★ 吳鐵松* 吳麗霞（廣東深圳市龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院藥劑科 深圳 518110）

1 前言

白芷為傘形科植物川白芷（Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm）Benth.et Hook.f）或杭白芷（Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm）Benth.et Hook.f.Var.formosana（Boiss）Shan et Yuan）的干燥根。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。《中國(guó)藥典》各個(gè)版本均有收載。白芷性溫味辛，歸胃、大腸、肺經(jīng)。具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿之功效，用于感冒頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶異常、瘡瘍腫痛等病癥[1-2]。黃酮類(lèi)化合物廣泛分布在植物界中，因具有各種顯著生物活性已成為目前研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)黃酮類(lèi)化合物因其獨(dú)特的功效，常作為降血糖、降血脂、抗心律失常、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物予以應(yīng)用[3]。白芷的化學(xué)成分主要為香豆素類(lèi)和揮發(fā)油類(lèi)，也含有黃酮類(lèi)化合物[4]。在白芷的化學(xué)成分含量測(cè)定的研究上，近年來(lái)主要對(duì)香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)進(jìn)行大量的研究，例如已報(bào)道采用薄層掃描法[5]、反相高效液相色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、毛細(xì)管色譜法[8]等方法對(duì)白芷中一種或幾種主要香豆素含量測(cè)定。但未見(jiàn)有白芷的黃酮類(lèi)化合物含量測(cè)定，此方面實(shí)屬空缺，值得研究。本試驗(yàn)采用微波輔助提取法提取總黃酮，采用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

UV-4501S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（天津市港東科技有限公司），電子分析天平（廈門(mén)精藝科技有限公司），電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），XH-100A微波快速制樣系統(tǒng)（北京祥鵠科技有限公司）。

2.2 試劑

白芷（購(gòu)于樟樹(shù)中藥飲片公司，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院生藥教研室鑒定）：蘆丁精品（由廣東藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）：石油醚、無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉均為分析純。

3 方法與結(jié)果

3.1 白芷中總黃酮的乙醇提取

將5.0g原藥材粉（過(guò)40目篩）置于60%乙醇水溶液200mL中室溫浸泡2h，置于微波（溫度50度，功率500W）中提取2次，合并提取液，粗提取液經(jīng)石油醚萃取，用60%乙醇濃縮定容至100mL，作為待測(cè)液。

3.2 蘆丁對(duì)照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取120℃干燥后的蘆丁對(duì)照品10.5mg，加入適量60%乙醇，稍加熱溶解，冷卻后用60%乙醇定容至100mL，搖勻備用，配成質(zhì)量濃度為0.0105 mg/mL的蘆丁對(duì)照溶液。

3.3 紫外分光光度法測(cè)白芷醇提液中總黃酮

3.3.1 最大吸收峰的確定：在190-500nm波段，以1nm為間隔對(duì)蘆丁對(duì)照液和樣品進(jìn)行光譜掃描如下圖1，結(jié)果蘆丁在205nm處出現(xiàn)最大吸收峰，樣品在該處也有最大吸收峰。

圖1 蘆丁對(duì)照液和白芷醇提液的紫外吸收?qǐng)D

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別置于試管中，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇稀釋至10mL，搖勻。以60%乙醇為空白，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，并以蘆丁用量（mg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作曲線，得回歸方程：Y=0.1762X+0.0108，r=0.9993。

表1 蘆丁對(duì)照品線性關(guān)系考察

圖2 不加顯色劑的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.3 中藥白芷提取物中總黃酮含量測(cè)定：吸取1mL待測(cè)樣，用60%乙醇定容至10 mL，以60%乙醇作空白液，在205 nm處測(cè)定吸光度，并代入回歸方程計(jì)算總黃酮的含量。

3.4 絡(luò)合-分光光度法測(cè)定白芷提取物中的總黃酮含量

3.4.1 AlCl3顯色法

3.4.1.1 最大吸收峰的確定：在190-1 000nm波段，以1nm為間隔對(duì)蘆丁對(duì)照液和樣品進(jìn)行光譜掃描如下圖3，結(jié)果：蘆丁約在510nm處出現(xiàn)最大吸收峰，樣品在該處也有最大吸收峰。

圖3 AlCl3顯色的蘆丁對(duì)照液和白芷醇提液紫外吸收?qǐng)D

3.4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別置于6支試管中，然后分別加入定量的AlCl3溶液，并用60%乙醇稀釋至10mL。以60%乙醇為空白，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.126X+0.022，r=0.9975

表2 AlCl3顯色的蘆丁對(duì)照品線性關(guān)系考察

圖4 AlCl3顯色的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4.1.3 樣品黃酮含量的測(cè)定：取1mL白芷醇提液，加入AlCl3溶液顯色，用60%乙醇定容至10mL，以60%乙醇為空白，測(cè)吸光度，并代入回歸方程計(jì)算總黃酮的含量。

3.4.2 Al（NO3）3顯色法

3.4.2.1 最大吸收峰的確定：在190-1 000nm波段，以1nm為間隔對(duì)蘆丁對(duì)照液和樣品進(jìn)行光譜掃描如上圖3，結(jié)果蘆丁約在510nm處出現(xiàn)最大吸收峰，樣品在該處也有最大吸收峰。

3.4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 ，5.0mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別置于試管中，均加入5%NaNO20.1mL，搖勻，放置6分鐘后均加入10%Al（NO3）30.1mL，搖勻，放置 6 分鐘，再分別加入1moL/LNaOH 3mL，搖勻，放置15分鐘，然后以50%乙醇為空白，在510nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.1687X-0.0012，r=0.9972。

表3 A（lNO3）3顯色的蘆丁對(duì)照品線性關(guān)系考察

圖5 Al（NO3）3顯色的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4.2.3 樣品黃酮含量的測(cè)定：分別吸取1mL醇提液，按3.4.2.2操作，以60%乙醇作空白液，測(cè)510nm處的吸光度，并代入回歸方程計(jì)算總黃酮的含量。

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上3種方法得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果如見(jiàn)表4。

表4 3種方法測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

由表4可知采用不加任何顯色劑的方法測(cè)得的總黃酮含量最高，可能原因是60%乙醇-水溶液使甾體、果膠、低聚糖、蹂質(zhì)、色素及其他多酚類(lèi)物質(zhì)一起提取出來(lái)，這些雜質(zhì)尤其是色素嚴(yán)重干擾測(cè)定，使得測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

絡(luò)合-分光光度法可以避免醇溶性有關(guān)雜質(zhì)的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用了AlCl3顯色法和Al（NO3）3絡(luò)合法測(cè)定白芷醇提液中黃酮含量，由表4可知Al（NO3）3絡(luò)合法測(cè)得的總黃酮含量比AlCl3絡(luò)合法測(cè)得的總黃酮含量要高。Al（NO3）3絡(luò)合法的基本原理是先用NaNO2還原黃酮，黃酮類(lèi)化合物中的3-羥基、4-羥基、5-羥基、4-羰基或鄰二位酚羥基，與Al3+進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，最后加NaOH溶液（在堿性條件下）使黃酮類(lèi)化合物開(kāi)環(huán)，生成2′-羥基查耳酮紅色絡(luò)合物而顯色，從而進(jìn)行顯色定量。該法源于蘆丁含量測(cè)定法，并逐步用于黃酮類(lèi)化合物的測(cè)定后來(lái)發(fā)現(xiàn)這并不是黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬反應(yīng)，因?yàn)榉簿哂幸仓挥芯哂朽彵蕉u基的物質(zhì)，均能用此法進(jìn)行顯色定量[9]。而AlCl3顯色法其反應(yīng)原理是黃酮母核上有3-OH和或5-OH，B環(huán)上有鄰位二經(jīng)基時(shí)（這是黃酮類(lèi)化合物的典型結(jié)構(gòu)），AlCl3可與之生成黃色的黃酮鋁配合物[10]，從而進(jìn)行顯色定量。AlCl3顯色法測(cè)定時(shí)蘆丁、桑色素等黃酮類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)強(qiáng)烈，而對(duì)酚酸、原花色素的反應(yīng)很小，因此該法對(duì)黃酮類(lèi)化合物的專(zhuān)屬性較強(qiáng)，適于白芷總黃酮的測(cè)定[11]。

本實(shí)驗(yàn)白芷醇提液中總黃酮并未經(jīng)過(guò)純化處理，可能這些雜質(zhì)能與Al（NO3）3絡(luò)合從而干擾測(cè)定。另外Al（NO3）3絡(luò)合法使用了強(qiáng)堿NaOH溶液，提取液中可能含有天然色素，這些色素會(huì)在堿液顯色，從而造成測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生偏差[11]。而相對(duì)影響AlCl3顯色法的因素較少，測(cè)定結(jié)果偏差較小。兩種方法的結(jié)果分析結(jié)果相近，分別為58.6mg、60.0mg。因此采用影響因素較少的AlCl3顯色法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:89.

[2]張富強(qiáng)，聶紅，韋藝，等.白芷的化學(xué)與藥理研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，18（3）:190

[3]Manach C，Donovan J L.Pharmacokinetics and metabolism of dietaryflavonoids in humans[J].Free Radical Research，2004，38（8）:771-785.

[4]Cherng J M，Chiang W，Chi L C.angImmunomodulatory activities of common vegetables and spices of Umbelliferae and its related coumarins and flavonoids[J].Food Chemistry，2008，106（3）:944-950.

[5]李宏宇，戴躍進(jìn)，張海波，等.不同商品白芷中香豆素的薄層掃描法測(cè)定含量[J].華西藥學(xué)雜志，1990，5（3）:165

[6]李宏宇，戴躍進(jìn)，謝成科.川白芷中香豆素類(lèi)成分的反相高效液相色譜分析[J].華西藥學(xué)雜志，1990，5（4）:231

[7]馬逾英，鐘世紅，賈敏如，等.紫外分光光度法測(cè)定川白芷中總香豆素類(lèi)成分的含量[J].華西藥學(xué)雜志，2005，20（2）:159-160.

[8]Yi Chen，Guorong Fan，Bin Chen，et al.Separation and quantitative analysis of coumarin compounds from Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm）Benth.et Hook.F by pressurized capillary electrochromatography[J].J Pharmacut Biomed，2006，41（1）:105-116.

[9]胡冠時(shí)，姜淑琴，楊進(jìn)黃酮化合物的鄰位二羥基顯色反應(yīng)的探討[J].藥學(xué)通報(bào)，1980，15（5）:2-3.

[10]中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所.黃酮體化合物鑒定手冊(cè)[M].北京：北京科學(xué)出版社，1981.

[11]徐寶才，丁霄霖.苦蕎黃酮的測(cè)定方法[J].江蘇：無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，22（2）:98-101.