響應面分析法優化重組原動蛋白2β 誘導條件的研究

張小鋒

響應面分析法(RSM)是一種基于響應變量與輸入變量關聯性研究的函數關系，也是一種工藝優化的有效方法［1］，目前被廣泛應用于食品、生物、化工、農業等多個領域，并獲得了較好效果［2］。原動蛋白2 具有生物節律傳遞性、神經元遷移影響性、促進胃腸道平滑肌收縮等作用。原動蛋白2 在基因轉錄過程中經可變剪接的mRNA 翻譯后加工處理可形成一種衍生蛋白質因子，稱為“原動蛋白2β(PK2β)”。目前生物學對于PK2β 的研究內容不多，本研究主要采用RSM 方法對重組PK2β 的誘導條件及影響因素進行研究和探討，為基因生物學蛋白質制備等提供有效依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料Luria-Bertani(LB)培養基配置:10 g/L 胰蛋白胨(Tryptone)，10 g/L 氯化鈉(NaCl)，5 g/L 酵母提取物(Yeast extract)，并利用NaOH 將培養基溶液的pH 值調整至7.4［3］。溴酚藍由北京精益精化工有限有責任公司提供。考馬斯亮藍由上海滬宇生物有限公司提供。卡那霉素由四川方向藥業有限責任公司提供。IPTG 由武漢鴻雨新科技有限公司提供。丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺均選用超級純純度，由上海生工生物工程有限公司提供。冰醋酸、過硫酸銨、乙醇等均選用分析純純度，由南京化學試劑有限公司提供。PK2β 表達重組菌株E.coli BL21(DE3)由上海浩然生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 誘導方法:LB 培養基30 ml 加入卡那霉素，重組菌株E.coli BL21(DE3)取3 μl 凍存液接種于培養基上，轉入220 r/min轉速和37℃恒溫條件下的電動機中過夜。以0.1%的比例將培養后的種子菌液接種于LB 培養基，同樣220 r/min轉速和37℃恒溫條件下培養，測定OD600 達到設定值時，將IPTG 加入種子菌液中，誘導PK2β 表達重組。

1.2.2 分析軟件:PK2β 表達量采用光密度掃描法檢測，采用Quantity one v4.62 生物圖像處理軟件進行定量分析，聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析采用北京伯樂生命科學工作者發展有限公司提供的Mini-Protean 3 電泳系統。

1.2.3 觀察指標:采用單因素分析方法。先對誘導時機和誘導物濃度進行固定，變動誘導時間，分析誘導時間與PK2β 表達量的關聯性;再對誘導時間和誘導物濃度進行固定，變動誘導時機，分析誘導時機與PK2β 表達量的關聯性;最后對誘導時間與誘導時機進行固定，變動誘導物濃度，分析誘導物濃度與PK2β 表達量的關聯性。根據單因素分析結果對誘導條件進行關系優化，將三種因素各取3 個高水平點值，采用回歸方程進行響應面分析。方程表示為［4，5］:

式中，Yi 表示預測響應值，Xi 表示三大因素的水平值，i=1為誘導時間，i=2 為誘導時機，i=3 為誘導物濃度，βi、βij、β0分別表示線性偏移項、二階偏移項和偏移項。

2 結果

2.1 誘導時間 固定誘導時機OD600 為0.6，誘導物濃度為1 mmol/L，變動誘導時間設置為1 ～9 h，每間隔1 h 進行1 次測定和記錄。具體測定PK2β 表達量隨著誘時間的延長，PK2β表達量逐漸上升并趨于平緩;其中6 h 時為峰值，為最佳誘導時間;4 ～9 h 曲線平穩，為最佳誘導時間段。見圖1。

圖1 不同誘導時間下單因素PK2β 表達量變化趨勢圖

2.2 誘導時機固定誘導時間為6 h，誘導物濃度為1 mmol/L，變動誘導時機OD600 為0.1 ～0.9，每間隔0.1 進行1 次測定和記錄。具體測定PK2β 表達量隨著誘導時機的變化，PK2β 表達量上升至峰值又呈現下降趨勢;其中OD600 為0.4 時為峰值，為最佳誘導時機;OD600 為0.3 ～0.8 時，PK2β表達量相對較高，為最佳誘導時機。見圖2。

圖2 不同誘導時機下單因素PK2β 表達量變化趨勢圖

2.3 誘導物濃度固定誘導時間為6 h，誘導時機OD600 為0.4，變 動 誘 導 物 濃 度 設 置 為0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L。具體測定PK2β 表達量隨著誘導物濃度的提升，PK2β 表達量先上升然后趨于平穩;0.5 ～5 mmol/L 為最佳誘導物濃度范圍。見圖3。

圖3 不同誘導物濃度下單因素PK2β 表達量變化趨勢圖

2.4 響應面分析響應面分析結果顯示，誘導時間為7 h、誘導時機OD600 為0.5、誘導物濃度為0.1 mmol/L 時，重組PK2β表達量為最優。

3 討論

隨著我國醫療事業的不斷發展與發達，對疾病的治療與預防已經逐漸深入到生物學、分子學領域。基因工程又被稱為“DNA 重組技術”，是通過將不同來源的基因在體外進行重組與拼接而形成雜種DNA 分子，再導入到活細胞中，從而獲得更加優質的生物遺傳因子，生產新品種［6，7］。基因工程技術在對重組蛋白質進行表達時，表達效果受到載體、宿主菌體、目的基因、誘導條件等影響，而誘導條件主要包括誘導時間、誘導時機和誘導物濃度。

但是，基因工程菌表達重組蛋白時可能對其它蛋白的表達產生影響和干擾，從而影響細胞自身代謝能力及細胞生長與增殖能力，因而研究和探討重組蛋白的最佳條件具有重要意義。一方面使菌體個體呈現良好的生理狀態，另一方面也使菌群整體處于高密度、高生長狀態，從而盡可能高的獲得重組蛋白的表達。

誘導時間的延長可以使菌體內部積累起更大含量的重組蛋白，然而，當積累時間過長時，易對量產的效率產生影響，而且一些菌體可能因自溶造成重組蛋白的胞內損失。在本組研究中我們發現，在誘導時機與誘導物濃度不變的情況下，隨著誘導時間的延長，PK2β 表達量初期上升并逐漸趨于平穩，且在6 h 達到最佳的誘導時間。誘導時機不可過早或過晚，過早可能使菌的總體密度尚未達到理想值時即開始進行蛋白的表達重組，加大了菌體的代謝負擔，影響增殖;而時機若過晚，則菌的個體生理狀態達不到良好效果，從而降低了單位蛋白的表達重組水平，對于整體的表達水平提升產生影響。本組研究中，在誘導時間和誘導物濃度不變的情況下，隨著誘導時機的發展，PK2β 表達量逐步上升至峰值，再逐漸下降，而OD600 為0.3 ～0.8時，PK2β 表達量相對較高，為最佳誘導時機。誘導物濃度的高低影響了其誘導效率，用量不足，無法發揮對蛋白表達重組的啟動作用，影響蛋白水平的高表達;而用量過高則引起過度表達而影響整體密度，也達不到較好的重組蛋白表達水平。本組研究中，在誘導時間與誘導時機不變的情況下，隨著誘導物濃度的增加，PK2β 表達量快速上升后趨于平穩，而0.5～5 mmol/L 為最佳誘導物濃度范圍。

當然，為了進一步了解三種因素的相關性，以便于在實踐過程中通過三種誘導條件的有效配比來實現最佳的PK2β 表達量，本組研究還采用了RSM，利用回歸方程將誘導時間、誘導時機和誘導物濃度結合起來［8］，最終獲得結論:誘導時間為7 h、誘導時機OD600 為0.5、誘導物濃度為0.1 mmol/L時，重組PK2β 表達量為最優。

1 魏娜，羅敏，曾一梅，等.響應面法優化重組工程菌的發酵工藝條件.生物技術，2010，20:69-72.

2 Choi J，Lee PC，Kim JH，et al.FM-P33 Medium optimization for the production of astaxanthin by paracoccussp using response surface methodology.J Biosci Bioeng，2009，108(Suppl 1):129-132.

3 陳魁主編.試驗設計與分析.第5 版.北京:清華大學出版社，2008.94-98.

4 劉斌，郭紅麗，鈕小松，等.基因重組酵母工程菌優化表達人源泉膠原蛋白.南京理工大學學報，2011，35:558-560.

5 杜少平，梁淑娃，楊冠東，等.響應面法優化兩歧雙歧桿菌發酵培養基.生物技術通報，2008，24 增刊:431-435.

6 苗猛猛，王旭靜，唐巧玲，等.抗蚜基因工程研究進展.生物技術進展，2012，2:104-108.

7 蓋樹鵬.基因工程實踐教學改革的探索.科技信息，2012，5:18-20.

8 熊春紅，彭康年，謝明勇.響應面法優化超聲輔助提取原子熒光法快速測定茶葉痕量汞.光譜學與光譜分析，2011，31:2843-2846.