NF-κB、MMP-9 在宮頸癌組織中的表達及意義

趙玉嬋 李蓮 張連梅 劉曉蘭

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其發生發展是涉及多基因、多階段的復雜變化過程，核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是其中重要的一種核轉錄因子，參與調控多種細胞因子、粘附因子的轉錄過程，在炎癥、免疫反應及腫瘤的發生發展中起重要作用［1］。MMP-9(matrix metalloproteinase)是細胞外基質降解的關鍵酶，有研究發現MMP-9 在多種惡性腫瘤中過表達，參與腫瘤的侵襲轉移過程［2］。但有關宮頸癌組織NF-κB 和MMP-9 表達狀況的研究甚少報道。本研究采用免疫組織化學SP 法檢測宮頸癌(CSES)、子宮頸上皮內瘤樣變(CIN)及正常子宮頸組織(NCE)中NF-κB 和MMP-9 蛋白的表達狀況，分析其與臨床病理特征的關系及意義，為闡明宮頸癌侵襲和轉移的機制及判斷預后提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院2010 年8 月至2011 年12 月手術切除、且經病理確診的宮頸癌組織存檔蠟塊標本80 例。患者均為女性，年齡30 ～68 歲，平均年齡46.5 歲。所有患者均無肝、腎及免疫系統疾病，術前均未接受放療、化療和內分泌治療，臨床病理資料完整。宮頸癌病理分級及臨床分期分別參照WHO(1999 年)和FIGO(1996 年)制定的標準。病理分級:高分化21 例，低分化14 例，中分化45 例;臨床分期:Ⅰa 期13 例，Ⅰb期15 例，Ⅱa 期18 例，Ⅱb 期22 例，Ⅲ期以上12 例。80 例乳腺癌中有腋窩淋巴結轉移者32 例，無腋窩淋巴結轉移者48例。同時選取經宮頸活檢證實為子宮頸上皮內瘤樣變(CIN)70例(CINⅠ19 例，CINⅡ25 例，CINⅢ26 例)及正常子宮頸組織(NCE)50 例作為對照。3 組患者的年齡和體重相比差異無統計學意義(P ＞0.05)。

1.2 主要試劑兔抗人NF-κB 多克隆抗體、兔抗人MMP-9 多克隆抗體購自Santa Cruz 公司。免疫組化SP 試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 實驗方法標本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟，采用免疫組織化學染色SP 法測定NF-κB、MMP-9 的表達，嚴格按照試劑盒說明書操作，用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS 代替一抗作為陰性對照:3%H2O237℃孵育10 min 滅活內源性過氧化物酶，PBS 洗滌;微波修復抗原，PBS 洗滌;10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min;用1∶50稀釋的NF-κB、MMP-9 多克隆抗體4℃過夜孵育，PBS 沖洗;加生物素標記的抗人IgG 抗體室溫孵育30 min，PBS 沖洗;辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素室溫孵育30 min，PBS 沖洗;DAB 顯色;蘇木素染色，封片，光鏡觀察。

1.4 判定標準NF-κB、MMP-9 陽性染色判定標準為細胞質(核)內檢出棕黃色顆粒。隨機選取5 個有代表性的視野計數200 個細胞，若陽性細胞占同類細胞百分比＜10%為陰性。

1.5統計學分析 應用SPSS 10.0 統計軟件，計數資料采用χ2檢驗比較各組間蛋白表達差異，相關性比較采用Spearman等級相關性分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB、MMP-9 蛋白在CSES、CIN 及NCE 中的表達免疫組化結果顯示，NF-κB 蛋白主要定位于細胞核和細胞質中，MMP-9 蛋白主要定位于細胞膜和細胞質中，呈線狀棕黃色顆粒。在CSES、CIN 及NCE 中，NF-κB 陽性表達率分別為72.5%(58/80)、18.6%(13/70)、0(0/50)，MMP-9 陽性表達率分別為68.8%(55/80)、15.7%(11/70)、0(0/50)，NF-κB、MMP-9 蛋白在CSES 的陽性表達率顯著高于CIN 和NCE，差異有統計學意義(P ＜0.05);NF-κB、MMP-9 在CIN 和NCE 中的表達無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 不同宮頸組織NF-κB、MMP-9 蛋白表達的比較例(%)

2.2 NF-κB、MMP-9 表達與宮頸癌臨床病理特征的關系NFκB、MMP-9 的陽性表達與宮頸癌不同病理分級、臨床分期及淋巴結轉移情況密切相關，差異有統計學意義(P ＜0.05)，而與患者年齡和組織學類型無關(P ＞0.05)。見表2。

2.3 NF-κB、MMP-9 在宮頸癌中表達的相關性80 例宮頸癌組織中，NF-κB、MMP-9 表達呈明顯正相關(r =0.872，P ＜0.05)。見表3。

3 討論

NF-κB 是轉錄基因家族的重要成員，正常情況下與其抑制物I-κB 結合，在細胞質中呈失活狀態。當細胞受到刺激后，NF-κB 與I-κB 解離并易位到細胞核中，與相應的靶序列結合，調控Bcl-2、c-myc、MMP-9 等基因的轉錄和表達，參與免疫和炎癥反應。研究發現，NF-κB 作為一種多向性、多功能核轉錄因子，在乳腺癌、肝癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中過表達，通過調控細胞增殖在腫瘤的發生發展、侵襲和轉移中發揮重要作用［3］。

表2 NF-κB、MMP-9 表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

表3 NF-κB、MMP-9 在宮頸癌中表達的相關性比較 例

多項研究表明，宮頸癌組織和細胞系中存在NF-κB 的活性上調［4，5］。本實驗中我們采用免疫組化法檢測發現，NF-κB 蛋白在CSES 中的陽性表達率顯著高于CIN 和NCE(P ＜0.05)，提示NF-κB 的異常表達可能是宮頸癌發生發展的重要機制之一。有關NF-κB 在宮頸癌中的作用機制尚不十分清楚，目前研究顯示NF-κB 可能通過抑制細胞凋亡導致腫瘤發生，其可能機制有:(1)誘導凋亡抑制基因Bcl-2 的表達和活化;(2)誘導癌基因c-myc 的激活;(3)上調cyclinD1 的表達，促使細胞周期從G1/G0 期向S 期轉化，導致細胞異常增殖。

MMP-9 是MMPs 家族的重要成員之一，參與細胞外基質和血管壁基底膜的降解和破壞。研究發現MMP-9 在幾乎所有的惡性腫瘤組織中均表達增高，參與腫瘤的侵襲和轉移［6］。本實驗結果顯示，MMP-9 蛋白在CSES 中的陽性表達率顯著高于CIN 和NCE(P ＜0.05)，提示MMP-9 的異常表達參與了宮頸癌的侵襲和轉移。研究發現在人類MMP-9 基因啟動子區域存在NF-κB 等轉錄因子的結合位點，NF-κB 與其結合后可調控MMP-9 基因的轉錄。Yoonseo［7］采用南蛇藤素抑制NF-κB 的活性后能夠顯著抑制MMP-9 基因的表達，從而抑制乳腺癌細胞MCF-7 的侵襲和轉移。由此可見，腫瘤的侵襲和轉移過程中至少有2 個或2 個以上基因的異常表達并相互配合，從而導致腫瘤的發生發展。

本實驗結果表明，NF-κB、MMP-9 的表達與患者年齡及病理類型無關，而與腫瘤組織分級、臨床分期和淋巴結轉移情況密切相關，提示細胞惡變程度越高，分期越晚及發生遠處轉移時，NF-κB、MMP-9 表達越顯著。由此看出，NF-κB 的激活通過調控其下游基因MMP-9 的轉錄和表達，導致細胞的惡性轉化和宮頸癌的侵襲轉移。

1 Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B:the enemy with in.Cancer Cell，2004，6:203-208.

2 李嬋玉，李力.MMP-9 及其相關因子與宮頸癌.重慶醫學，2012，41:3545-3547.

3 Qiao L，Yu J，Dent P，et al.NF-kappa B protects rat ARL-6 hepatocellular carcinoma cells against hydrogen peroxide induced apoptosis.Cancer Biol Ther，2005，4:1195-1202.

4 Du CX，Wang Y.Expression of P-Akt，NF-kappaB and their correlation with human papillomavirus infection in cervical carcinoma.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33:274-277.

5 Li J，Jia H，Xie L，et al.Association of constitutive nuclear factor-kappaB activation with aggressive aspects and poor prognosis in cervical cancer.Int J Gynecol Cancer，2009，19:1421-1426.

6 Roomi MW，Monterrey JC，Kalinovsky T，et al.In vitro modulation of MMP-2 and MMP-9 in human cervical and ovarian cancer cell lines by cytokines，inducers and inhibitors.Oncol Rep，2010，23:605-614.

7 Yoonseo K.Celastrol inhibits breast cancer cell invasion via suppression of NF-κB-mediated matrix metalloproteinase-9 expression.Cell Physiol Biochem，2011，28:175-184.