泰山白花丹參提取物體外對氧化應激損傷內皮祖細胞作用的研究

焦 鵬，楊娜娜，崔英杰，秦樹存

(泰山醫學院動脈粥樣硬化研究所，山東泰安 271000)

內皮祖細胞參與的內皮系統損傷的修復是動脈粥樣硬化的始動因素和重要環節［1-2］。氧化應激和炎癥是動脈粥樣硬化發展的兩個關鍵成分，同時活性氧是動脈粥樣硬化炎癥發生的始動因素［3］。前期實驗證實，泰山白花丹參提取物對H2O2損傷后內皮祖細胞有顯著保護作用，但其具體機制尚不是很明確。本實驗擬從氧化應激和炎癥方面探討泰山白花丹參提取物對內皮祖細胞的保護作用。

1 材料

1.1 細胞 內皮祖細胞的培養和鑒定本課題組已成功完成［4-5］，在本院生命科學研究中心細胞培養間常規傳代培養。

1.2 試劑與藥品 白花丹參(產自泰山)由山東大學博士生導師夏作理教授鑒定，白花丹參提取物的制備參見參考文獻［4-5］;EBM—2培養基購自Lonza公司;人淋巴細胞分離液購自天津TBD公司;DiI-Ac-LDL，FITC-UEA-I購自BTI公司;人纖維連接蛋白，PE-VEGFR-2，PE-CyTM5-CD34購自美國BD公司;超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;人用IL-6 ELISA試劑盒和人用TNF-α ELISA試劑盒均購自深圳市達科為生物技術有限公司;二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)購自Sigma。

1.3 儀器 BD FACScalibur流式細胞儀，美國 BD公司;LG 16—W高速微量離心機，北京醫用離心機廠;BIO—RAD Model 550酶標儀，日本;MCO—15AC CO2培養箱，日本三洋株式會社。

2 方法

2.1 實驗分組 內皮祖細胞原代培養7 d后，以0.25%胰酶將各孔細胞消化制成細胞懸液，以同等數量細胞接種隨機分為正常對照組、H2O2損傷組(0.001%H2O2)、白花丹參+H2O2組(白花丹參質量濃度分別為0.2、0.4、0.8 g/L，每組同時加0.001%H2O2)，培養24 h后，進行各項指標檢測。

2.2 ELISA方法檢測培養液中白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平 分組處理細胞后收集培養液上清，離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書中實驗步驟操作，吸光度值于酶標儀450 nm波長處測定，根據預實驗所作的標準曲線計算樣本的濃度。

2.3 黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶(SOD)活力收集各組細胞培養液上清，按試劑盒說明書加好各試劑后，混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調零，測各組吸光度值，實驗每組重復測一次。根據吸光度值計算總SOD活力。

2.4 細胞活性氧水平檢測 將細胞以相同密度接種于6孔培養板，過夜，按不同分組處理完后，吸棄培養液加入1∶1000用無血清培養液稀釋的 DCFH-DA(終濃度為10μmol/L)，37℃培養箱內孵育30 min。PBS洗滌3次后，胰酶消化，收集細胞，流式細胞儀488 nm激發下檢測FL1通道熒光。

3 結果

3.1 培養液中白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的檢測 與正常對照組相比，過氧化氫損傷后顯著升高了內皮祖細胞上清液的IL-6和TNF-α質量濃度(P＜0.01)，白花丹參提取物干預后，與單純損傷組相比降低了IL-6和TNF-α，各質量濃度白花丹參組與單純損傷組相比有顯著性差異(表1)。

表1 培養上清中IL-6和TNF-α的質量濃度變化()

表1 培養上清中IL-6和TNF-α的質量濃度變化()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01;與H2O2損傷組比較 ，#P＜0.01(圖1同)

組 別 IL-6/(ng·L－1) TNF-α/(ng·L－1)60.43±12.89 49.18±14.14 H2O2損傷組 189.56±13.59* 232.34±25.89*0.2g/L白花丹參+H2O2 70.65±9.18# 49.45±10.09#0.4 g/L白花丹參+H2O2 51.19±10.24# 33.2±8.48#0.8 g/L白花丹參+H2O2 40.14±10.67# 38.8±6.98正常對照組#

3.2 白花丹參對氧化損傷后細胞總超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響 0.001%H2O2作用內皮祖細胞后，總超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯下降，而在0.2、0.4和0.8 g/L白花丹參共同作用下，SOD活性比損傷組有了顯著的改善(圖1)。

圖1 各組別SOD活力測定

圖2 各組別活性氧水平測定

3.3 各組細胞內活性氧水平變化 流式檢測結果表明損傷組細胞內FL1平均熒光強度明顯高于對照組，說明過氧化氫損傷后細胞內活性氧的產生明顯升高，0.2 g/L白花丹參組與過氧化氫損傷組比較差別不大，而0.4 g/L和0.8 g/L白花丹參質量濃度組活性氧水平與過氧化氫損傷組比較明顯降低(P＜0.05)，見圖2。

4 討論

目前，世界范圍內心血管疾病的發病率和死亡率都在逐年上升，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是主要的病理基礎［6-7］。AS是多因素所致病變，主要有血管內皮功能障礙、炎癥、氧化應激等［8］。眾所周知，AS屬慢性炎癥增殖性疾病，炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化的全過程，細胞因子及氧化應激產物在炎癥反應中起重要作用，內皮細胞的損傷及功能紊亂是AS發生的始動環節，并貫穿于AS進展的全過程，因此靶向修復血管內皮，糾正內皮細胞功能紊亂，可有效抑制AS的形成和發展［9-12］。由于成熟內皮細胞是終末分化細胞，修復受損內皮的能力有限。近年來諸多研究表明血管內皮細胞外的干細胞可修復血管大面積創傷，因而提出了內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)修復假說［13-14］。由于在一些疾病狀態下，EPC的數量和功能都有所降低，那么是否可以人為地恢復和增強病理狀態下內皮祖細胞的生物學活性和功能就成為目前研究的熱點。

超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物體內的一種內生性氧自由基清除劑，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。SOD活力水平是公認的可間接反映機體內自由基水平的重要指標之一，它與自由基水平呈負相關。而MDA的量常常可反映脂質過氧化的程度，間接的反映出細胞損傷的程度。活性氧具有較強的氧化作用，在有機體中少量活性氧的存在并不會造成明顯的氧化損傷，目前研究表明細胞內的活性氧參與了凋亡的過程。當細胞受到一些因素刺激時，通過細胞膜上NADPH氧化酶系統作用產生大量活性氧。過多的活性氧會引起DNA損傷、脂質過氧化而觸發細胞發生凋亡［15］。目前普遍認為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，IL-6、TNF-α兩者在炎癥反應急性相中聯系緊密，IL-6是預測心血管事件的獨立危險因子［16］。

本課題組前期實驗證實，白花丹參能改善H2O2引起的內皮祖細胞增殖抑制和凋亡增加的現象。本實驗主要對這一現象的機理進行了研究，發現過氧化氫刺激內皮祖細胞后，炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌有顯著性升高，SOD活力明顯下降而且細胞內活性氧明顯增加，而白花丹參干預后，這些癥狀都有明顯改善，說明白花丹參提取物對內皮祖細胞氧化損傷影響的機制可能是提高了該細胞的抗氧化酶活性、降低了炎癥因子的釋放并且清除了細胞內過多的活性氧。

［1］周曉峰，王 佐.內皮祖細胞在動脈粥樣硬化進程中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15(12):940-942.

［2］張美華，張 偉，蓋 凌，等.血管內皮祖細胞在治療動脈粥樣硬化中的作用［J］.中國心血管雜志，2012，17(1):73-75.

［3］陳 瑗，周 玫.氧化應激-炎癥在動脈粥樣硬化發生發展中作用研究的新進展［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(10):757-762.

［4］焦 鵬，常 起，陳 彬，等.泰山白花丹參提取物對H2O2誘導的人臍血內皮祖細胞損傷的保護作用及機制［J］.中國中藥雜志，2011，36(13):1830-1832.

［5］焦 鵬，常 起，陳 彬，等.泰山白花丹參提取物對人臍血內皮祖細胞增殖、黏附及分泌NO的影響［J］.中華中醫藥雜志，2011，26(11):2687-2689.

［6］吳 雷，童志平，唐 康，等.動脈粥樣硬化的藥物治療的研究進展［J］.熱帶醫學雜志，2008，8(9):987-989.

［7］陳 鵬.動脈粥樣硬化藥物治療的研究進展［J］.醫學信息，2011，24(8):5040-5041.

［8］彭琪琦，羅興林.氧化應激在動脈粥樣硬化中的作用及研究現狀［J］.瀘州醫學院學報，2010，33(6):710-712.

［9］周凱章，林輝麗.血紅素氧化酶-1對小鼠動脈粥樣硬化斑塊抑制作用的研究［J］.福建醫藥雜志，2008，30(1):89-90.

［10］秦 瑾，劉正湘.炎癥與動脈粥樣硬化［J］.實用心腦肺血管病雜志，2003，11(2):105-108.

［11］崔忠生，邸科前，馬煥云.哈巴苷及哈巴俄苷對腎上腺素損傷血管內皮細胞的保護作用［J］.山東醫藥，2009，49(25):60-61.

［12］張 寧，尹美娜，李 聰，等.炎癥與動脈粥樣硬化［J］.臨床薈萃，2010，25(10):918-921.

［13］O’Neill T J，Wamhoff B R，Owens G K，et al.Mobilization of bone marrow-derived cells enhances the angiogenic response to hypoxia without transdifferentiation into endothelial cells［J］.Circ Res，2005，97(10):1027-1035.

［14］Zentilin L，Tafuro S，Zacchigna S，et al.Bone marrow mononuclear cells are recruited to the sites of VEGF－induced neovascularization but are not incorporated into the newly formed vessels［J］.Blood，2006，107(9):3546-3554.

［15］任振義，白春學，金一尊，等.多烯紫杉醇誘導SPC－A1肺癌細胞凋亡與活性氧之間的關系［J］.中國癌癥雜志，2003，13(4):342-344.

［16］叢也彤，亓 波，金龍哲，等.64排螺旋 CT檢測冠心病患者冠狀動脈斑塊分型的分布特點與其血清 IL-6、TNF-A含量的相關性［J］.中國老年學雜志，2009，29(19):2446-2448.