檸檬催化轉化原人參二醇組皂苷制備人參皂苷Rg5的初步研究

孫成鵬，高維平，趙寶中，成樂琴*

(1.東北師范大學化學學院，吉林 長春 130024;2.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

人參Panax ginseng C.A.Meyer屬五加科草本植物，我國重要名貴藥材，其應用有超過4000年的歷史［1］。人參皂苷是人參的主要活性成分之一，現代藥理研究表明，人參皂苷具有抗衰老、抗腫瘤、抗自由基、保護神經和保護心血管等作用［2-9］。

人參皂苷Rg5最初從紅參中分離得到［10］，屬次級人參皂苷，是原人參二醇組皂苷(PPD)的代謝產物。人參皂苷Rg5具有抗接觸性皮炎［11］、抗腫瘤［12］、抑制環氧合酶-2［13］和改善肺部炎癥［14］等作用，特別在改善記憶力方面，其藥效遠優于人參皂苷 20(S)-Rg3 和 20(R)-Rg3［15］。由于人參皂苷Rg5的制備和分離難度較大［16］，在其制備過程中，生成副產物較多，如人參皂苷Rk1和Rz1，同時其分離僅可以通過制備型高效液相色譜和高速逆流來實現，故有關人參皂苷Rg5的制備及其藥理研究報道較少，目前，僅有炮制人參和專利［17］兩種方法，但上述方法產率很低，因此有必要開發人參皂苷Rg5的制備方法。

本實驗選用生物質材料檸檬為催化劑，PPD皂苷為原料，低成本環境友好地制備高附加稀有人參皂苷Rg5(圖1)，結合硅膠柱層析和半制備型高效液相色譜分離人參皂苷 Rg5和 Rk1，并通過HPLC、1H-NMR和13C-NMR進行定量分析和結構鑒定。

1 材料

人參皂苷對照品 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、20(S)-Rg3和20(R)-Rg3購自成都曼斯特公司;PPD皂苷自制(純度為98.51%，其中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd的含有量分別為48.60%、19.11%、16.95%、4.72%和9.13%);人參皂苷對照品Rg5為自制(根據峰面積歸一化法測得其純度為99.33%);蒸餾水自制，乙醇、丙酮為分析純，乙腈和甲醇為色譜純。

圖1 人參皂苷Rg5的制備方案Fig.1 Method of preparation of ginsenoside Rg5

P230P型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);JJ—1大功率電動攪拌器(常州國華電器有限公司);DK—98—Ⅱ型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法

2.1 稀有人參皂苷Rg5和Rk1的制備 向原人參二醇組皂苷溶液(20 mg/mL)中加入80%的檸檬汁水溶液(1∶2.5，V∶V)，于100℃反應2 h。反應產物經飽和碳酸鈉中和后，用水飽和正丁醇萃取5次，合并有機層，于50℃旋轉蒸發儀蒸干。殘留物甲醇溶解(4 mL)，0.45μm濾膜過濾，進行HPLC定量分析。

2.2 稀有人參皂苷Rg5和Rk1的分離 將上述反應產物做成樣品膠，以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑(8.5∶1.5，V/V)，利用硅膠柱層析分離得到人參皂苷Rg5、Rk1和Rz1的混合物。將上述混合物溶于甲醇，經半制備型高效液相色譜 ［Hypersil C18，250 mm×20 mm，10μm，乙腈-水(39 ∶61)，15 mL/min］分離得到三個餾分，分別為化合物1(27.5 mg)、2(18 mg)以及2和3的混合物(20.5 mg)。

2.3 HPLC分析

2.3.1 有機酸測定 將檸檬用榨汁機榨成汁，冷凍殺菌，放置于冰箱內儲存。取1 mL檸檬汁加入蒸發皿中，于70℃蒸干。殘留物用80%乙醇溶解(8 mL)，經離心和濾膜(0.45μm)過濾，用于HPLC分析。Damonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，二極管陣列檢測器，進樣量 20μL，柱溫30℃，體積流量 0.8 mL/min。流動相為0.1%磷酸水溶液。HPLC分析結果，見圖2。

圖2 檸檬中有機酸HPLC譜圖Fig.2 HPLC analyses of organic acids in lemon

由圖2可知，檸檬中主要含有檸檬酸和蘋果酸，且檸檬酸的量遠大于蘋果酸。HPLC定量分析表明，檸檬中蘋果酸的量為0.14 mg/mL，檸檬酸的量為20.20 mg/mL，其含有量為蘋果酸的144倍，且檸檬的pH為2.46，酸性較強，因此，可用其代替傳統HCl、H2SO4和HAc等催化劑，用于人參皂苷Rg5的制備。

2.3.2 反應產物測定 YMC J'sphere ODS-H80色譜柱(4.6 mm×250 mm，4μm)，UV檢測器，檢測波長為203 nm，進樣量20μL，柱溫30℃，體積流量1 mL/min。流動相A為乙腈，B為水。梯度洗脫程序:0～30 min，30% ～40%A;30～37 min，40% ～50%A;37～45 min，50% ～51%A;45～60 min，51% ～55%A;60～60.10 min，55% ～90%A;60.10～75 min，90%A;75～75.10 min，90% ～30%A。HPLC分析結果，見圖3。

圖3 人參皂苷對照品(A)和反應產物(B)的局部HPLC譜圖Fig.3 HPLC profile analysis of refer ginsenosides(A)and reaction product(B)

圖3-A為人參皂苷對照品的HPLC分析圖，人參皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3和Rg5的保留時間分別出現在16.3、18.2、 20.2、 21.1、 25.2、 43.5、 44.4、 58.2 min。圖3-B為反應產物的HPLC分析圖，與圖3-A相比，保留時間在15 min～28 min之間沒有出現任何信號峰，說明原料人參皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd均已完全轉化。由圖3-A可知，人參皂苷Rg5的信號峰出現在保留時間58.2 min，圖3-B中，保留時間在56.4 min處出現的信號峰，推測為人參皂苷 Rk1與 Rz1［18］混合物，而保留時間58.3 min出現的信號峰可以認定為人參皂苷Rg5，對其定量分析結果表明，收率為30.77%，得率為21.53%。

3 結構鑒定

將化合物1和2溶于氘代吡啶，采用BRUKER AVANCEⅡ核磁共振儀(Switzerland，500 MHz)測定上述兩種化合物的1H-NMR和13C-NMR。

化合物1:白色粉末(乙腈);1H-NMR(pyridine-d5，500MHz) δ:0.85(3H， s，-CH3)，0.99(3H， s，-CH3)，1.05(3H， s，-CH3)，1.13(3H， s，-CH3)，1.32(3H， s，-CH3)，1.61(3H， s，-CH3)，1.65(3H， s，-CH3)，1.84(3H，s，-CH3)，3.31(1H，dd，J=4.0 Hz，C3-H)，3.94(1H，s，C12-H)，4.94(1 H，d，J=7.5 Hz，C1'-H)，5.38(1 H，d，J=7.5 Hz，C1″-H)，5.25(1H，t，C24-H)，5.53(1H，t，C22-H);13C-NMR結果見表1。

化合物2:白色粉末(乙腈);1H-NMR(pyridine-d5，500MHz) δ:0.83(3H， s，-CH3)，0.98(3H， s，-CH3)，1.03(3H， s，-CH3)，1.13(3H， s，-CH3)，1.32(3H， s，-CH3)，1.61(3H， s，-CH3)，1.68(3H， s，-CH3)，3.31(1H，dd，J=4.0 Hz，C3-H)，3.94(1H，s，C12-H)，4.96(1H，d，J=7.5 Hz，C1'-H)，5.41(1 H，d，J=7.5 Hz，C1″-H)，4.93(1H，s，C21-H)，5.17(1H，s，C21-H)，5.30(1H，t，C24-H);13C-NMR結果見表1。

在化合物1的1H-NMR中，δ 0.85～1.84分別出現了C-19、C-30、C-18、C-29、C-28、C-27、C-26和C-21的8個-CH3氫信號峰，δ 5.25和5.53分別為C-24和C-22的雙鍵氫的信號峰。在化合物1的13C-NMR中，共出現42個碳信號峰，其中 δ 105.44和106.37為兩個糖端基碳信號峰，δ 140.54、123.65、124.05和 131.62分別為 C-20、C-22、C-24和C-25的雙鍵碳信號峰，而其他1HNMR和13C-NMR數據與文獻 ［19］基本一致，故化合物1鑒定為人參皂苷Rg5。

化合物2是在制備人參皂苷Rg5過程中副產的次級人參皂苷，其1H-NMR的數據與化合物1基本相似，只是在δ 0.83～1.68之間只有7個-CH3氫信號峰，分屬于 C-19、C-30、C-18、C-29、C-28、C-27和C-26的-CH3的氫。此外，由于C-21雙鍵碳上亞甲基的兩個氫所處化學環境不同，存在有兩個信號峰，分別在δ 4.93和5.17;另一個雙鍵碳(C-24)的氫信號峰出現在δ 5.30。在化合物2的13C-NMR中，化合物2的C-20、C-21和C-22與化合物1存在著明顯不同，其信號峰分別出現在δ155.91，108.48和 34.24。化合物 2的其他1HNMR和13C-NMR數據與文獻［19］基本一致，故化合物2鑒定為人參皂苷Rk1。

4 人參皂苷Rg5的反應機理

從圖4可以看出，PPD轉化為人參皂苷Rg5的途徑為PPD→Rg3→Rg5，同時生成副產物人參皂苷Rk1和Rz1。PPD皂苷在酸性條件下，首先生成人參皂苷Rg3，再進一步脫水生成人參皂苷Rg5及其副產物。由于人參皂苷Rg3在水中溶解度很低進而形成沉淀，阻礙了人參皂苷Rg3進一步脫水。此外，人參皂苷Rg3在脫水過程中，存在著3種不同的脫水方式，分別生成人參皂苷Rg5(脫水方式符合扎伊切夫規則，E-構型)，人參皂苷 Rk1(脫水方式符合霍夫曼規則)和Rz1(脫水方式符合扎伊切夫規則，Z-構型，與人參皂苷Rg5屬于順反異構體)。然而，在上述3種產物中，由于人參皂苷Rg5的脫水方式符合扎伊切夫規則，同時其構型為E-構型，屬于優勢構象，故其在3種產物中產率較高。從上述分析結果可以看出，若能提高中間產物人參皂苷Rg3溶解度和其脫水的選擇性，人參皂苷Rg5的收率勢必將有質的提高。

圖4 人參皂苷Rg5的反應機理Fig.4 Reaction mechanism of ginsenoside Rg5

5 結論

稀有人參皂苷Rg5為PPD皂苷的次級代謝產物，在抗腫瘤、改善記憶力和抗接觸性皮炎等方面療效顯著。由于人參皂苷Rg5的中間體人參皂苷Rg3在水中溶解度較小，而給其制備帶來了一定的難度，故有關人參皂苷Rg5制備及藥理活性研究報道較少。實驗結果表明，PPD皂苷溶液經檸檬汁處理，人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd的轉化率達到100%，人參皂苷Rg5收率為30.77%，得率為21.53%。與專利方法［17］相比，人參皂苷Rg5的制備不需任何氣體(氮氣)保護，操作簡單，反應時間短，相對于專利縮短了22 h，同時其得率提高了6.83%。這對于研究人參皂苷Rg5的藥理活性及開發相關保健品具有重要參考價值。

［1］孫光芝，劉 志，張俊杰.人參二醇組皂苷的藥理學研究概況［J］.有機農業與食品科學，2005，21(2):136-140.

［2］包海鷹，李 磊，昝立峰，等.黑根霉對人參皂苷Re的生物轉化［J］.菌物學報，2010，29(4):548-554.

［3］Leung K W，Yung K K，Mak N K，et al.Angiomodulatory and neurological effects of ginsenosides［J］.Curr Med Chem，2007，14(12):1371-1380.

［4］Yue P Y，Mak N K，Cheng Y K，et al.Pharmacogenomics and the Yin/Yang actions of ginseng:anti-tumor，angiomodulating and steroid-like activities of ginsenosides［J］.Chin Med，2007，2:6.

［5］Kang K S，Yokozawa T，Yamabe N，et al.ESR study on the structure and hydroxyl radical-scavenging activity relationships of ginsenosides isolated from Panax ginseng C.A Meyer［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(5):917-921.

［6］王國賢，肖志潔，宗瑞義.人參二醇皂甙對小鼠急性腦缺血損傷的保護作用［J］.錦州醫學院學報，2001，22(6):5-7.

［7］Wu Q G，Hu J Y，Wang Z W.Research progress on the ginsenoside Rg3 in prevention and treatment of tumor and its effective mechanism［J］.Guiding Journal of TCM，2005，11(8):87-89.

［8］Liu T G，Huang Y，Cui D D，et al.Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 combined with gemcitabine on angiogenesis and growth of lung cancer in mice［J］.BMC Cancer，2009，9(1):250-260.

［9］Kim J H，Cho S Y，Lee J H，et al.Neuroprotective effects of ginsenoside Rg3 against homocysteine-induced excitotoxicity in rat hippocampus［J］.Brain Res，2007，1136(1):190-199.

［10］Kitagawa I，Yoshikawa M，Yoshigara M，et al.Chemical studies on crude drug precession.I.on the constitution of Ginseng Radix Rubra(1)［J］.Yakugaku Zasshi，1983，103:612-622.

［11］Shin Y W，Bae E A，Kim D H.Inhibitory effect of ginsenoside Rg5 and its metabolite ginsenoside Rh3 in an oxazoloneinduced mouse chronic dermatitis model［J］.Arch Pharm Res，2006，29(8):685-690.

［12］Park I H，Piao L Z，Kwon S W，et al.Cytotoxic dammarane glycosides from processed ginseng［J］.Chem Pharm Bull，2002，50(4):538-540.

［13］Yoo H H，Park J H.Cyclooxygenase inhibitory activity of ginsenoside from heat-processed ginseng［J］.Food Chem，2012，133(3):998-1000.

［14］Kim T W，Joh E H，Kim B，et al.Ginsenoside Rg5 ameliorates lung inflammation in mice by inhibiting the binding of LPS to toll-like receptor-4 on macrophages［J］.Int Immunopharmacol，2012，12(1):110-116.

［15］張 晶，王世榮，陳全成，等.人參皂苷Rg3(R)，Rg3(S)，Rg5/Rk1對乙醇致小鼠記憶阻礙改善作用的影響［J］.吉林農業大學學報，2006，28(3):283-284.

［16］田 桐，宋建國，趙 慕，等.人參皂苷Rg3與Rg5的分離及Rg3異構體的拆分［J］.大連工業大學學報，2011，30(2):109-112.

［17］楊 凌，何克江，楊 義.一種人參二醇型皂甙酸水解制備人參皂甙Rk1和Rg5的方法:中國，CN1463980A［P］.2003-12-31.

［18］Kwon S W，Han S B，Park I H，et al.Liquid chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng［J］.J Chromatogr A，2001，921(2):335-339.

［19］Park H I，Han S B，Kim J M，et al.Four new acetylated ginsenosides from processed ginseng(Sun Ginseng)［J］.Arch Pharm Res，2002，25(6):837-841.