齊墩果酸和綠原酸對HepG2細胞及P450酶的影響

湯 浩，劉曉莉，王 銳，高慶劍，陸 鋮，孫志博

(1.甘肅省人民醫院藥劑科，甘肅蘭州 730000;2.寧夏醫科大學藥學院藥理系，寧夏銀川 750000;3.蘭州大學基礎醫學院遺傳所，甘肅蘭州 730000)

人體內主要藥物代謝酶是細胞色素P450家族，其中CYP1A1、CYP3A4是主要的誘導酶，前者能催化許多前致癌物轉化為致癌物［1］，后者代謝60%臨床常用藥物［2］，它們是藥物代謝/毒理學的重要指標。齊墩果酸臨床上主要用于治療急性黃疸型和慢性中毒性肝炎，并作為抗癌輔助藥物。經研究齊墩果酸具有保肝作用［3-4］，并且能夠誘導肝癌細胞HepG2細胞的凋亡［5］。綠原酸具有廣泛的藥理和生理活性，主要存在于杜仲，金銀花等植物中。有文獻報道，綠原酸具有抗肝纖維化和肝損傷的作用［6］，綠原酸對小鼠急性肝損傷的保護作用［7］，利福平是肝臟CYP450酶某些同工酶的誘導劑和抑制劑，影響其他藥物代謝［8］。因此本實驗選取齊墩果酸和綠原酸為研究對象，探討它們對HepG2細胞增殖、細胞周期、CYP1A1mRNA、CYP3A4 mRNA的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 齊墩果酸和綠原酸均購自中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用。利福平(上?；瘜W試劑有限公司)。采用二甲基亞砜(DMSO)助溶，DMSO在細胞液中的終濃度不超過0.1%。TaKaRa RNAiso Plus購自寶生物工程(大連)有限公司;Rever Ace qPCR RT Master Mix購自TOYOBO公司;實驗所用引物用Primer Premier 5.0軟件設計，委托上海生工合成;新生牛血清購自PAA公司;噻唑藍(MTT，美國 Sigma公司)。一次性細胞瓶(5×5 cm2)，細胞培養皿(100 mm)，96孔細胞培養板全部購自NUNC公司。

1.2 儀器 超凈臺，細胞培養箱，ABI7500實時熒光PCR，梯度 PCR測定儀(購自 PCR公司)，高速低溫離心機(SIGMA公司)，核酸蛋白測定儀。

1.3 HepG2 細胞株人肝癌細胞HepG2為本實驗室保存。HepG2接種于含10%新生牛血清、抗生素(100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養基中。HepG2細胞培養環境:5%CO2、37℃、相對濕度90%。HepG2細胞取對數生長期細胞用作實驗。

1.4 MTT方法 取對數生長期細胞，調整密度為5×104個/mL接種于96孔板中，100μL/孔，16 h后加入含不同質量濃度齊墩果酸、綠原酸和利福平的培養基，藥物終質量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL，每個質量濃度設5個復孔，同時設空白對照組和正常細胞生長組，藥物作用24 h后，加入5 mg/mL MTT，20μL/孔，繼續培養4 h后棄上清，加入DMSO 150μL/孔溶解，震蕩混勻10 min，在酶聯免疫檢測分析儀上測定A490nm值。按以下公式計算藥物細胞生長抑制率，實驗以3次平行實驗數據為最終結果。

細胞生長抑制率=(1－A實驗/A對照)×100%

1.5 細胞周期測定 取對數生長期的細胞，按1×106個/瓶接種于一次性細胞培養瓶，培養16 h后，用PBS清洗兩遍，加入含不同質量濃度藥物齊墩果酸和綠原酸的培養基，藥物質量濃度分別為100、50、25μg/mL，陽性對照利福平 10μg/mL，繼續培養24 h后，胰蛋白酶消化成單細胞液，收集細胞，用PBS洗滌細胞后，加入300μL PBS，再加入 －20℃預冷的無水乙醇 700μL，混勻，－20℃冰箱固定24 h以上，離心洗滌細胞后，加入終質量濃度20μg/mL的RNA酶，置于37℃水浴30 min，接著加入50μg/mL PI 300μL避光染色30 min，300目篩網過濾，2 h內流式細胞儀分析細胞周期。

1.6 齊墩果酸和綠原酸對HepG2細胞中CYP1A1、CYP3A4 mRNA表達的影響

1.6.1 分組 實驗組，齊墩果酸和綠原酸質量濃度為100、50、25μg/mL;陰性對照組，正常細胞生長組，陽性對照利福平10μg/mL。

1.6.2 RNA的提取和cDNA的合成 細胞接種于一次性細胞培養瓶，16 h后吸取舊的培養基，用PBS清洗兩遍，加入含不同質量濃度兩種藥物的培養基，藥物作用時間為24 h。用RNAiso Plus試劑盒提取RNA之后，用核酸蛋白測定儀檢測A260/A280比值，鑒定 RNA的純度。RNA溶解于15μL RNse-free H2O中，5μL用于測定 RNA的純度，8μL用于反轉錄。反轉錄體系為5×RT Master Mix 2μL，RNA 溶解液 8μL，反轉錄總體積 10μL。反轉錄的條件為37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃5 min，反轉錄產物4℃保存。

1.6.3 實時熒光PCR反應 將反轉錄產物10倍稀釋后作為PCR反應模板，PCR的反應體系為:1μL稀釋液，上下游引物 10μmol/L(表 1)各1μL，2×SYBR Green I 12.5μL，添加高壓滅菌的三蒸水至終體積25μL，混勻。反應條件:起始95℃ 5 min，擴增時95℃ 15 s，60℃15 s，72℃45 s循環40次，溶解曲線分析。以GADPH為內參，進行PCR擴增產物的實時定量分析。

實時定量PCR數據采用比較閾值法進行相對定量分析。計算方法:目的基因誘導或抑制倍數=2－ΔΔCt，Ct值是熱循環儀中熒光達到閾值循環數，ΔΔCt=實驗組ΔCt(目的基因Ct－內參基因Ct)－對照組ΔCt(目的基因Ct－內參基因Ct)。計算每一個標本目的基因的拷貝數。

表1 實時熒光PCR引物Tab.1 Sequence of primer used in real-time PCR

1.7 數據統計學分析 所有試驗數據用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學分析，數據均用“”表示，采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 齊墩果酸和綠原酸對HepG2細胞增殖的影響MTT實驗結果表明，隨著齊墩果酸和綠原酸質量濃度的增大，對HepG2細胞抑制率明顯升高，并且具有明顯的劑量依賴關系。質量濃度低于50μg/mL時，綠原酸對HepG2細胞的抑制作用比齊墩果酸強，但質量濃度高于50μg/mL，齊墩果酸對HepG2的抑制作用明顯高于綠原酸。在50μg/mL時，兩種藥物的抑制率相同。利福平6.25～200μg/mL對HepG2細胞的抑制作用都在40%左右，抑制作用較強。在下述細胞周期和實時熒光定量PCR實驗中選擇藥物處理質量濃度為100、50和25μg/mL，陽性對照利福平10μg/mL。觀察齊墩果酸、綠原酸和利福平對HepG2細胞周期和CYP1A1 mRNA、CYP3A4 mRNA表達的影響。見圖1。

圖1 齊墩果酸、綠原酸和利福平對HepG2細胞增殖的影響Fig.1 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and rifampicin on proliferation of HepG2 cells

2.2 流式細胞術測定3種質量濃度齊墩果酸和綠原酸對HepG2細胞周期的影響 經3種藥物不同質量濃度藥物處理后，HepG2細胞各時期細胞數占細胞總數的百分比與正常對照組相比較，有些細胞周期分布發生了明顯變化。齊墩果酸25μg/mL和綠原酸 50、25μg/mL、陽性對照利福平 10μg/mL均對細胞周期沒有明顯影響。齊墩果酸的100、50μg/mL 和綠原酸的100μg/mL 均對HepG2細胞周期S期發生了明顯阻滯。見圖2。

圖2 不同質量濃度齊墩果酸、綠原酸對HepG2細胞周期的影響Fig.2 Different concentrations of oleanlic acid and chlorogenic on the cell cycle of HepG2 cells

2.3 實時熒光PCR檢測兩種藥物不同質量濃度對HepG2細胞中CYP1A1 mRNA表達的影響 實驗結果顯示，齊墩果酸在3個質量濃度均可明顯誘導HepG2細胞中CYP1A1 mRNA表達，給藥質量濃度從大到小誘導倍數依次為2.48、1.45、2.34。綠原酸3個質量濃度均可明顯抑制HepG2細胞中CYP1A1 mRNA表達，給藥質量濃度從大到小抑制倍數依次為1.91、0.61、2.82，陽性對照利福平10μg/mL的誘導倍數為2.3相對較弱。見圖3。

圖3 齊墩果酸、綠原酸和利福平對HepG2細胞CYP1A1 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of oleanolic acid，chlorogenic acid and rifampicin on the expression of in CYP1A1 mRNA HepG2 cells

2.4 實時熒光PCR檢測兩種藥物不同質量濃度對HepG2細胞中CYP3A4 mRNA表達的影響 實驗結果顯示，齊墩果酸在3個質量濃度均可明顯誘導HepG2細胞中CYP3A4 mRNA表達，給藥質量濃度從大到小誘導倍數依次為1.17、2.42、8.40。綠原酸 100、50μg/mL均可抑制 HepG2細胞中CYP3A4 mRNA表達，抑制倍數依次為 0.65、1.00，綠原酸 25μg/mL HepG2細胞中 CYP3A4 mRNA表達可明顯誘導HepG2細胞中CYP3A4 mRNA表達，誘導倍數為0.59，誘導相對較弱，陽性對照利福平10μg/mL能顯著誘導HepG2細胞中CYP3A4 mRNA表達，誘導能力較強。見圖4。

3 討論

藥物代謝酶在藥物的代謝解毒和代謝活化中起著重要的作用［9］。研究中藥成分對 CYP的影響，為預測有關中西藥之間相互作用，提高中藥有效成分的有效性和安全性具有重要意義。

圖4 齊墩果酸、綠原酸和利福平對HepG2細胞CYP3A4 mRNA表達的影響Fig.4 Effect of oleanolic acid and chlorogenic acid and rifampicin on theexpression ofin CYP3A4 mRNA cells HepG2

齊墩果酸和綠原酸是一種天然藥物，國內對其提取分離及藥理作用研究較多，但很多作用機制尚處于研究探索階段［10］。因此，進一步研究兩種藥物抗腫瘤機理及其藥物的體外代謝，顯得很有意義。HepG2細胞具有典型肝癌細胞的一系列惡性特征，最大的優點是保留了一系列生物轉化過程中的Ⅰ相和Ⅱ相酶，是研究和評價防治肝癌藥物的較理想細胞模型。

MTT實驗結果表明，200～6.25μg/mL齊墩果酸和綠原酸均可抑制肝癌細胞 HepG2生長，50μg/mL時，兩種藥物的抑制率相同，說明齊墩果酸和綠原酸是潛在防治肝癌的中藥制劑，利福平在一定范圍能顯著抑制肝癌細胞生長。細胞周期在腫瘤的生長調控中具有重要的作用，通過改變細胞周期來阻止腫瘤細胞的無限增殖已受到人們的關注［11］。細胞周期的調節主要發生在2個重要階段:G1-S期和G2-M期。齊墩果酸和綠原酸的有效質量濃度處理HepG2細胞，使S期細胞顯著降低，兩種藥物有可能通過影響細胞周期而抑制細胞生長。

近年來認為CYP1A1活化苯并芘等多種多環芳烴化合物使其致癌［12］，并且CYP1A1的誘導能力是作為評價致癌性的重要指標。本研究發現，齊墩果酸和綠原酸的三個有效質量濃度均能誘導的CYP1A1 mRNA表達，由于齊墩果酸和綠原酸對CYP1A1的誘導是否可能增加機體對毒性物質代謝發生變化，對機體造成一定的損害，長期服用含齊墩果酸和綠原酸的藥物是否對機體有潛在的毒副作用，對藥物代謝性相互作用的影響，有待于進一步實驗研究。

CYP3A4可同時氧化代謝多種藥物，導致藥效的增強(降低)或毒副作用的增加［13］。由于其代謝的廣泛性，進一步影響了藥物的藥效學和毒理學。本實驗結果顯示，齊墩果酸高、中、低3個質量濃度是CYP3A4的誘導劑，而綠原酸的低質量濃度是CYP3A4的抑制劑，兩種藥物與其他藥物合用時，能夠影響其他藥物的血藥濃度和生物利用度，對藥物相互性作用的影響有待于進一步研究，利福平是肝癌細胞的強誘導劑。有相關文獻報道［4-15］，齊墩果酸能抑制肝癌細胞SMC-7721、Hep3B的增殖和誘導其凋亡。

綜上所述，本實驗分析了齊墩果酸和綠原酸對HepG2細胞周期和兩種CYP450酶的誘導作用。本實驗結果初步證明齊墩果酸和綠原酸對CYP450酶系的誘導作用，實驗結果為中西藥代謝相關性提供了體外實驗的數據支持。兩種藥物體內是否也存在CYP450酶的誘導或者抑制作用，有待于進一步的實驗研究。

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