貫葉連翹提取物長期給藥對大鼠的肝腎毒性

謝家駿，周廣興，喬正東，王建新

(1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203;2.復旦大學實驗動物科學部，上海 200032;3.上海市浦東醫(yī)院醫(yī)學科研與創(chuàng)新中心，上海 201399;4.復旦大學藥學院，上海 201203)

貫葉連翹Hypericum perforatum L.為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，屬臨床上用于治療抑郁癥的有效藥物，先后被《美國草藥典》、《德國藥典》等收載。國內(nèi)具有豐富的貫葉連翹植物資源，近年來基于該植物資源的深度開發(fā)受到了廣泛關注。前期本課題組采用現(xiàn)代藥理手段和提取分離技術成功開發(fā)了貫葉連翹提取物，該提取物抗抑郁活性強，有效成分含量高，其中含黃酮類成分的量超過50%。有文獻報道，黃酮類化合物具有抗氧化和促氧化的雙重作用［1-3］，過量攝入會產(chǎn)生細胞毒性，甚而導致肝腎等臟器的損傷［4-5］。為了確保臨床用藥的安全性，本實驗選用大鼠為受試動物，以其肝腎等重要臟器為靶器官，觀察貫葉連翹提取物長期給藥可能對其產(chǎn)生的毒性反應。

1 實驗材料

1.1 受試物 貫葉連翹提取物:深褐色浸膏粉，味微苦、微澀，含苯并二蒽酮類以金絲桃素(C30O16O8)計為1.76%，含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計為61.14%，由上海市中藥研究所植物化學研究室提供，批號001227。實驗時，先置研缽中研細，然后按3份受試物加5份淀粉的比例研勻，用蒸餾水配制成15%(15 g浸膏粉/100 mL)的受試藥液，然后，按需要用25%淀粉蒸餾水混懸液配制成7.5%和3.75%的受試藥液，隨配隨用。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半。實驗開始時鼠齡為四周，體質(zhì)量(60～75)g。由復旦大學實驗動物科學部提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號SCXK(滬)2002-0002號。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫22～24℃，相對濕度55% ～70%，照度15～20 Lux，12 h明暗交替。飼喂中外合資上海西普爾-必凱實驗動物有限公司生產(chǎn)的鼠用固體高壓料。

1.3 檢測儀器 SYSMEX F—800血液分析儀(日本東亞公司);COBAS EMIRA PLUS生化分析儀(瑞士羅氏公司);MA—4210尿液分析儀(桂林市華通醫(yī)用儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥 設受試物高、中、低3個劑量組，分別灌服貫葉連翹提取物 1.5、0.6、0.3 g/kg，每天1次，每周6次，連續(xù)26周，停藥后觀察8周。其中高劑量組單日用藥劑量為最大給藥劑量，為臨床擬用劑量的200倍;中劑量組單日用藥劑量高于藥效高劑量，為臨床擬用劑量的80倍;低劑量組單日用藥劑量高于藥效有效劑量，為臨床擬用劑量的40倍。另設空白對照組，灌服等容量25%淀粉蒸餾水混懸液。

2.2 操作步驟 給藥及恢復期間，每日觀察動物的外觀體征，行為活動，攝食情況，糞便性狀等，每周稱體質(zhì)量、食耗量。給藥13周、26周、停藥8周時，分別取10/34、14/34、10/34動物(雌雄各半)，禁食不禁水12 h后收集尿液作尿液常規(guī)檢查，眼眶動脈處采血作血液學和血清生化學檢查，戊巴比妥鈉麻醉后放血處死作系統(tǒng)尸解，取主要臟器作肉眼檢查，臟器稱定質(zhì)量及換算成臟器系數(shù)，并作石蠟切片、H.E染色及組織學鏡檢。

2.3 檢測項目

2.3.1 血液學檢查 白細胞數(shù)(WBC)，紅細胞數(shù)(RBC)，血紅蛋白(HGB)，紅細胞壓積(HCT)，紅細胞平均體積(MCV)，紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)，血小板數(shù)(PLT)，凝血時間(CT)，網(wǎng)織紅細胞百分率(Retic)，中性粒細胞百分率(Neut)，淋巴細胞百分率(Lymph)，單核細胞百分率(Mono)，嗜酸細胞百分率(Eos)，嗜堿細胞百分率(Baso)。

2.3.2 血清生化檢查 天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，尿素氮(BUN)，血糖(GLU)，堿性磷酸酶(ALP)，總膽紅素(TBIL)，總蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，總膽固醇(TCHO)和肌酐(CRE)。

2.3.3 尿液檢查 亞硝酸鹽(NIT)，酸堿值(PH)，尿糖(GLU)，尿蛋白(PRO)，隱血(BLD)，酮體(KET)，膽紅素(BIL)，尿膽元(URO)。

2.3.4 臟器系數(shù)測定 心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、腦濕質(zhì)量，并換算成臟器系數(shù)(臟體比)。臟器系數(shù)計算公式:臟器系數(shù)(臟體比)=［臟器濕質(zhì)量(g)÷體質(zhì)量(g)］×100%。

2.3.5 組織學鏡檢 心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、甲狀腺、胃、前列腺、睪丸、卵巢、子宮、腦。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 計量資料多組間均數(shù)比較，方差齊性時采用方差分析，方差不齊時采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料多組間均數(shù)比較，采用χ2檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般癥狀 受試物各劑量組及空白對照組大鼠活動正常，糞便成形，整個實驗過程中，未見動物死亡。

3.2 體質(zhì)量與食耗量變化 給藥18周以后，中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，與空白對照組比，18～26周時雄性大鼠體質(zhì)量增長下降顯著(P＜0.05或P＜0.01)。與此相對應，屆時中、高劑量組大鼠食耗量亦未見有明顯增加趨勢，與空白對照組比，雌性大鼠食耗量增長下降顯著(P＜0.05)。停藥后，中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長加快，食耗量增加，恢復期3～8周時，與空白對照組比均無顯著差異(P＞0.05)。見圖1～2。

圖1 貫葉連翹提取物對大鼠體質(zhì)量輕時變化的影響Fig.1 Effect of Hypericum perforatum extracts on the change of body weight of rats with time

圖2 貫葉連翹提取物對大鼠食耗量以時變化的影響Fig.2 Effect of Hypericum perforatum extracts on the change of food consumption of rats with time

3.3 血液學檢測 給藥13、26周及停藥8周時，各用藥組大鼠血液學各項指標平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。

3.4 血清生化檢測 給藥13周時，各用藥組大鼠TP、ALB呈一定的升高趨勢，其中，中劑量組大鼠ALP、中、高劑量組大鼠TP、ALB升高具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);給藥26周時，各用藥組大鼠TP、ALB、BUN升高(P＜0.01)，中、高劑量組大鼠 CREA、TBIL亦升高(P＜0.05)。其余各劑量組大鼠各時點各項血清生化學指標平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

3.5 尿液檢測 給藥13周時，中、高劑量組pH升高(P＜0.01)、URO降低(P＜0.05);給藥26周時，高劑量組URO降低(P＜0.05)。其余各用藥組大鼠各時點各項尿常規(guī)指標平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

3.6 大體尸檢 給藥13、26周和恢復期8周時，心臟外膜光滑濕潤，心肌呈紅褐色，外觀無異常;肝臟呈紅褐色，被膜光滑濕潤，質(zhì)實且柔軟，未見異常;腎表面光滑呈紅褐色，腎臟被膜易剝離，外觀無異常，腎切面皮、髓質(zhì)境界清晰。其余各臟器大小、顏色均正常，未見有腫脹、出血、壞死等異常現(xiàn)象。

3.7 臟器濕質(zhì)量和臟器系數(shù) 給藥13周時，低、中、高劑量組大鼠肝、腎及睪丸系數(shù)均呈一定的升高趨勢，與空白對照組比，低、高劑量組大鼠肝臟系數(shù)、中、高劑量組大鼠睪丸系數(shù)升高(P＜0.05);給藥26周時，中、高劑量組動物腎上腺濕質(zhì)量及其系數(shù)顯著上升(P＜0.01);其余各劑量組大鼠各時點各臟器濕質(zhì)量平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

3.8 病理學檢查 肝:空白對照組動物肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞呈索狀排列，未見明顯的變性、壞死和炎癥反應。給藥13周時，高劑量組大鼠出現(xiàn)肝細胞輕度顆粒樣變性3只(雄性1只，雌性2只)，脂肪變性1只(雄性1只)。給藥26周時，中劑量組大鼠出現(xiàn)肝細胞輕度顆粒樣變性2只(雄性1只，雌性1只)，脂肪變性有1只(雄性1只);高劑量組大鼠出現(xiàn)肝細胞輕度顆粒樣變性6只(雄性3只，雌性3只)，脂肪變性3只(雄性2只，雌性1只)，且均有不同程度的炎性細胞浸潤。空白對照組、低劑量組及停藥8周時各劑量組動物肝細胞均未見明顯的變性、壞死及炎癥反應。

腎:空白對照組動物腎被膜和腎小球結(jié)構(gòu)未見異常，各級腎小管、腎間質(zhì)及腎盂基本正常。給藥13周時，高劑量組大鼠腎臟近曲小管有輕度顆粒樣變性，其中雄性3只，雌性2只。給藥26周時，腎臟近曲小管呈輕度顆粒樣變性的中劑量組大鼠有4只(雄性1只，雌性3只)，高劑量組大鼠有11只(雄性7只，雌性4只)。空白對照組、低劑量組及停藥8周時各劑量組動物腎臟均未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒性異常反應。

腎上腺:空白對照組大鼠腎上腺被膜、皮質(zhì)和髓質(zhì)分界清楚，基本正常;腎上腺球狀帶、束狀帶和網(wǎng)狀帶排列整齊，細胞均未見異常。給藥26周時，中、高劑量組大鼠出現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)和/或髓質(zhì)增生。停藥8周后恢復正常。

除此之外，在給藥13、26周以及停藥8周時，各劑量組和對照組動物的心、脾、肺、胸腺、甲狀腺、胃、前列腺、睪丸、卵巢、子宮、腦等組織器官均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

表1 貫葉連翹提取物對大鼠血清生化學指標的影響()Tab.1 Effect of Hypericum perforatum extracts on serum biochemical indexes of rats()

表1 貫葉連翹提取物對大鼠血清生化學指標的影響()Tab.1 Effect of Hypericum perforatum extracts on serum biochemical indexes of rats()

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量組觀察指標 空白對照組 貫葉連翹提取物低劑量組 貫葉連翹提取物中劑量組 貫葉連翹提取物高(給藥13周，n=10)AST/(U/L) 246±118 221±84 235±109 158±49*ALT/(U/L) 82.2±21.9 92.4±26.0 79.2±18.7 68.2±13.7 BUN/(mmol/L) 7.88±0.74 8.43±0.83 8.57±0.87 7.98±0.46 GLU/(mmol/L) 5.40±0.84 5.86±1.28 7.08±1.54＊＊ 5.85±0.59 ALP/(U/L) 252±32 228±34 239±50 196±20＊＊TBIL/(μmol/L) 1.18±0.48 1.00±0.61 1.12±0.63 0.78±0.51 TP/(g/L) 73.4 ±2.9 77.3 ±4.7* 78.4 ±4.0＊＊ 79.7 ±3.3＊＊ALB/(g/L) 45.1±1.8 46.5±2.3 46.6±2.3 47.5±1.5＊＊TCHO/(mmol/L) 1.55±0.22 1.53±0.22 1.53±0.16 1.56±0.13 CREA/(μmol/L) 34.2±3.8 35.5±3.6 36.1±4.4 34.1±3.8(給藥26周，n=14)AST/(U/L) 153±27 150±22 170±73 146±20 ALT/(U/L) 58.9±6.5 58.2±10.0 79.7±70.5 63.4±14.0 BUN/(mmol/L) 7.40±0.72 8.79±0.66＊＊ 9.22±0.58＊＊ 9.14±0.95＊＊GLU/(mmol/L) 4.28±0.73 4.34±0.40 4.42±0.31 4.68±0.45 ALP/(U/L) 220±25 188±43* 196±36 201±59 TBIL/(μmol/L) 0.71±0.47 0.64±0.50 1.21±1.25 1.21±0.70*TP/(g/L) 71.0±3.9 76.8 ±2.8＊＊ 77.4 ±3.4＊＊ 78.6±3.2＊＊ALB/(g/L) 40.4±2.7 43.8 ±1.6＊＊ 44.1 ±1.9＊＊ 44.7±2.2＊＊TCHO/(mmol/L) 2.12±0.24 2.26±0.29 2.26±0.25 2.41±0.11＊＊CREA/(μmol/L) 37.9±3.0 38.9±4.5 40.5±3.2* 41.1±3.3*(恢復期8周，n=10)AST/(U/L) 155±62 130±24 137±66 121±14 ALT/(U/L) 60.4±17.1 50.5±8.7 51.1±27.7 55.2±6.5 BUN/(mmol/L) 7.56±0.91 8.62±1.48 7.42±1.07 7.14±1.99 GLU/(mmol/L) 4.80±0.54 4.49±0.57 4.65±0.89 5.03±0.49 ALP/(U/L) 167±36 172±56 173±48 172±23 TBIL/(μmol/L) 0.20±0.42 0.20±0.42 0.40±0.52 0.10±0.32 TP/(g/L) 75.3±2.3 79.1±5.7 71.8±5.6 75.4±3.8 ALB/(g/L) 44.2±2.8 46.8±4.0 42.0±3.4 44.3±3.4 TCHO/(mmol/L) 1.98±0.30 2.14±0.39 1.93±0.38 1.96±0.51 CREA/(μmol/L)37.5±3.6 42.2±10.6 37.9±3.2 36.5±4.2

表2 貫葉連翹提取物對大鼠尿常規(guī)指標的影響()Tab.2 Effect of Hypericum perforatum extracts on urinalysis indexes of rats()

表2 貫葉連翹提取物對大鼠尿常規(guī)指標的影響()Tab.2 Effect of Hypericum perforatum extracts on urinalysis indexes of rats()

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量組(給藥13周，n=10)觀察指標 空白對照組 貫葉連翹提取物低劑量組 貫葉連翹提取物中劑量組 貫葉連翹提取物高NIT 0±0 0±0 0±0 0±0 pH 6.50 ±0.71 6.95 ±0.64 7.65 ±0.63＊＊ 7.60 ±0.39＊＊GLU/(mmol/L) 0.06±0.19 0±0 0±0 0±0 PRO/(g/L) 0.36±0.32 0.29±0.25 0.27±0.28 0.30±0.21 BLD/(mg/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 KET/(mg/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 BIL/(μmol/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 URO/(μmol/L) 1.45±0.95 0.72±0.68 0.58±0.59* 0.58±0.59*(給藥26周，n=14)NIT 0±0 0±0 0.07±0.27 0.07±0.27 pH 6.26±0.80 6.18±0.86 6.29±0.89 6.64±0.87 GLU/(mmol/L) 0±0 0±0 0±0 0.04±0.16 PRO/(g/L) 0.57±0.30 0.50±0.41 0.43±0.40 0.37±0.30 BLD/(mg/L) 0.02±0.08 0±0 0.02±0.08 0±0 KET/(mg/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 BIL/(μmol/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 URO/(μmol/L) 1.99±1.41 1.40±0.60 1.60±0.37 1.00±0.75*(停藥恢復期8周，n=10)NIT 0±0 0±0 0±0 0±0 pH 6.45±0.50 6.05±0.76 6.05±0.16 6.40±0.57 GLU/(mmol/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 PRO/(g/L) 0.48±0.23 0.54±0.29 0.62±0.47 0.42±0.30 BLD/(mg/L) 0±0 0±0 0±0 0.50±1.58 KET/(mg/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 BIL/(μmol/L) 0±0 0±0 0±0 0±0 URO/(μmol/L)1.00±0.74 1.28±0.68 1.56±0.44 1.28±0.68

表3 貫葉連翹提取物對大鼠臟器系數(shù)的影響()Tab.3 Effect of Hypericum perforatum extracts on organ coefficients of rats()

表3 貫葉連翹提取物對大鼠臟器系數(shù)的影響()Tab.3 Effect of Hypericum perforatum extracts on organ coefficients of rats()

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量組(給藥13周，n=10)觀察指標 空白對照組 貫葉連翹提取物低劑量組 貫葉連翹提取物中劑量組 貫葉連翹提取物高心臟/% 0.362±0.029 0.377±0.035 0.364±0.044 0.347±0.047肝臟/% 3.62±0.21 4.00±0.26* 3.78±0.25 3.99±0.40*脾臟/% 0.220±0.048 0.227±0.042 0.205±0.025 0.204±0.044肺臟/% 0.548±0.114 0.527±0.085 0.553±0.061 0.541±0.113腎臟/% 0.691±0.061 0.720±0.047 0.713±0.042 0.736±0.045腎上腺/% 0.0191±0.0070 0.0200±0.0068 0.0195±0.0055 0.0184±0.0055甲狀腺/% 0.0054±0.0009 0.0055±0.0008 0.0057±0.0006 0.0053±0.0006腦/% 0.555±0.134 0.583±0.124 0.578±0.128 0.566±0.112(給藥26周，n=14)心臟/% 0.338±0.061 0.353±0.044 0.307±0.063 0.339±0.040肝臟/% 3.27±0.20 3.21±0.20 3.15±0.22 3.37±0.26脾臟/% 0.196±0.061 0.193±0.044 0.174±0.039 0.187±0.054肺臟/% 0.559±0.069 0.556±0.085 0.565±0.074 0.537±0.078腎臟/% 0.700±0.084 0.693±0.063 0.688±0.066 0.686±0.064腎上腺/% 0.0828±0.0638 0.0953±0.0745 0.1839±0.0520＊＊ 0.1967±0.0463＊＊甲狀腺/% 0.0062±0.0047 0.0053±0.0013 0.0049±0.0013 0.0050±0.0015腦/% 0.540±0.161 0.536±0.145 0.553±0.158 0.544±0.153(停藥恢復期8周，n=10)心臟/% 0.339±0.035 0.340±0.042 0.356±0.039 0.342±0.052肝臟/% 3.06±0.32 3.06±0.34 2.77±0.45 3.20±0.57脾臟/% 0.156±0.035 0.169±0.029 0.155±0.023 0.165±0.021肺臟/% 0.456±0.099 0.447±0.085 0.447±0.072 0.461±0.094腎臟/% 0.695±0.064 0.764±0.230 0.653±0.067 0.665±0.071腎上腺/% 0.0237±0.0071 0.0234±0.0066 0.0222±0.0055 0.0242±0.0058甲狀腺/% 0.0056±0.0017 0.0055±0.0015 0.0054±0.0016 0.0054±0.0015腦/% 0.433±0.127 0.440±0.133 0.440±0.130 0.484±0.139

4 討論

抑郁癥作為一種嚴重的精神障礙，目前其發(fā)病率已躍居世界十大常見疾病的第四位，預期2020年可能會上升為第二大常見疾病［6］，已成為突出的社會問題。在此背景下，貫葉連翹作為治療抑郁癥的全天然植物藥受到了社會的廣泛關注，其療效顯著、毒副作用少的鮮明特點已成為當前全球植物藥研發(fā)熱點品種之一。

貫葉連翹提取物是基于貫葉連翹植物中抗抑郁活性成分而提取富集的主要有效部位，其主要活性成分包括苯并雙蒽酮類、黃酮類和間苯三酚類等化合物［7］，且成分可控比例達50%以上。前期研究表明，貫葉連翹提取物可減少小鼠懸尾不動時間，減少大鼠強迫游泳不動時間，增強5-羥色胺酸甩頭行為，加強阿樸嗎啡降溫強度，其作用機制與通過對腦內(nèi)5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺等神經(jīng)遞質(zhì)重攝取具有抑制作用有關［8］。本實驗就其長期給藥對大鼠肝腎等主要臟器的影響進行了研究。結(jié)果顯示，貫葉連翹提取物連續(xù)灌胃13、26周對SD大鼠肝、腎組織和功能具有輕度的毒性作用，但停藥后可隨時間而逐步消失，其毒性程度與給藥劑量和服用持續(xù)時間呈正相關。貫葉連翹提取物灌胃給藥的安全劑量為0.3 g/kg，相當臨床治療抑郁癥擬用劑量的40倍。

在貫葉連翹提取物中，黃酮類化合物占50%以上，其中包括槲皮素、金絲桃苷、蘆丁、阿曼托黃素等成分［9］。黃酮類化合物屬植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于陸生維管束植物中［10］，在蔬菜、水果、藥用植物中普遍存在，其不僅是許多中草藥的主要活性成分，還是多種膳食中的營養(yǎng)物質(zhì)。但有文獻報道，某些類黃酮存在著潛在的因過量攝入產(chǎn)生的毒副作用。如長期大劑量攝入兒茶酚，可使嚙齒類動物出現(xiàn)肝臟損傷［5］。貫葉連翹提取物長期大劑量服用出現(xiàn)的輕度肝腎毒性是否與其含有50%以上比例的黃酮類化合物有關，有待作進一步的考證和研究。

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