單克隆抗體純化過程中內毒素去除方法分析

李彥英 ，王珙 ，李凌瑞 ，周振海 ，李娜 ，毛赟赟 ，李凱 ，王笑非 ，董曉杰

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；2.上海豐茂生物技術有限公司，上海 201506

細菌內毒素是熱原的一種，來自革蘭陰性菌的外膜。極微量的內毒素進入動物或人體內都會引發強烈的炎癥反應，導致輕微如發熱，重則死亡的嚴重后果[1]。各國藥監部門對生物產品中的內毒素含量均有嚴格規定。歐洲藥典規定注射劑內毒素限度不得高于5 EU/（kg·h）[2]，EU為內毒素單位，每EU內毒素約相當于100 pg。

細菌污染的風險在生物制藥工藝中廣泛存在。防止細菌污染，控制產品中內毒素含量是廣大生物制藥從業人員所面臨的巨大挑戰。生物藥物中，單克隆抗體藥物因為使用劑量大（幾十到幾百毫克），對內毒素限度的要求因而更高。單克隆抗體作為一類靶向藥物，以其突出的療效和較低的不良反應獲得了醫藥界的極大重視，單抗藥物的研發也異常活躍。單克隆抗體作為生物大分子藥物，生產和純化工藝復雜，有諸多環節可能將內毒素帶入生產工藝之中。因此，純化工藝步驟中有效去除內毒素的能力將為產品符合內毒素標準提供保障。

內毒素是脂多糖（LPS），其結構包含3個區域，即類脂A區、核心多糖區和特異性多糖區[3]。其中，核心區的磷酸化導致內毒素在一般蛋白溶液中帶負電荷[4]。內毒素的類脂部分為疏水區，使內毒素可以像一些雙極性分子一樣形成微球或微囊結構，將疏水區包裹在里面。內毒素單體的相對分子質量為10×103～20×103，其聚合形態的相對分子質量可超過1000×103[5]。

因為內毒素分子結構復雜且不均一，導致內毒素可以多種方式與溶液中的蛋白質相互作用，形成復合物，大大增加了去除的難度[6-7]。在蛋白溶液中去除內毒素需要著重考慮所用方法對內毒素的特異選擇性，即盡量減小蛋白的損失，又對內毒素有較高的親和力。多聚賴氨酸即表現出對內毒素有親和作用，以其作為配體的層析介質可以選擇性結合內毒素[8]。因為內毒素一旦在水溶液中聚集，分子大大增加，膜過濾/超濾法有望通過分子大小的不同將內毒素與蛋白分子分離[9]。同樣利用層析原理，精氨酸溶液沖洗已被證明可以將附著在固定相上的單抗分子內毒素去除[10]。

我們探討了以上3種方法在單克隆抗體純化過程中去除內毒素的應用，并分析了它們規模放大的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

單克隆抗體為中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達的重組蛋白，生產規模300 L，經多步純化，純度高于98%，抗體溶液為檸檬酸緩沖液（pH5.5）。

Pierce填料和試劑盒來自Thermo Fisher公司；2個規格的納米濾器均來自Millipore公司，Viresolve NFP Opticap 4英寸納米濾器膜面積0.16 m2，Vire?solve Pro Modus濾器膜面積0.22 m2，兩者孔徑均為20 nm，前者配0.1 μm PES膜除菌濾器為預過濾器，后者用 POD Viresolve Prefilter，面積 0.11 m2；蛋白A填料Mabselect來自GE公司；精氨酸和組氨酸均為國產分析純產品。

1.2 填料法

0.5 mL Spin柱的使用方法參見Thermo Fisher公司的產品說明書。先用0.2 mol/L NaOH/95% 乙醇和 2 mol/L NaCl對柱子再生，用 Tris-Cl（pH7.0）平衡后加入3.5 mL蛋白樣品，室溫搖動1 h，1500 r/min離心收集毒素去除樣品。

1.3 納濾法

納米濾器和預過濾器使用前先用緩沖液沖洗平衡，再用蠕動泵打入料液。控制流速，使納米濾器上游壓力保持在1～2 bar，超過2 bar即為堵塞，不能繼續使用。

1.4 氨基酸清洗法

蛋白A柱經3倍柱體積的Tris緩沖液（pH7.4）平衡后上樣，載量按35 mg/mL計算。此方法來自Rit?zen等的報道[10]并有所改動。蛋白上樣后經1倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，即開始氨基酸溶液沖洗，隨后氨基酸被20倍柱體積的平衡緩沖液沖洗去除，單抗即由洗脫液（50 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH3.8）洗脫。其中，精氨酸溶液為0.5 mol/L（pH7.4），組氨酸溶液為0.5 mol/L（pH6.3）。

1.5 單抗和殘留內毒素的檢測

單抗濃度檢測采用紫外吸光度法，按照該單抗吸光系數計算單抗濃度。內毒素檢測參照中國藥典2010年版內毒素凝膠限度法進行[11]，鱟試劑檢測限度為0.25 EU/mL。樣品經過1/2梯度稀釋，經判斷凝膠的形成獲得溶液內毒素濃度范圍。本工作中顯示的內毒素范圍不同，系樣品稀釋率不同所致。

2 結果

2.1 內毒素去除填料法

Pierce內毒素去除填料是一款離子交換介質，由多聚賴氨酸共價連接在纖維素基質上制成。多聚賴氨酸在填料pH值范圍內（pH6～8）帶正電荷，可以與帶負電荷的內毒素結合，并常用于去除內毒素的工藝中[8]。

蛋白溶液和填料混合孵育1 h后，用Spin柱收集流穿的蛋白樣品，發現起始含量為0.8（批次1）～8 EU/mg（批次2），小量單抗溶液中的內毒素均去除了70%，而單抗蛋白幾乎沒有損失（表1），與填料說明書中描述的可以達到的內毒素最低限度一致。

在進一步用內毒素去除填料的實驗中，對填料的使用條件，如靜態（將填料和蛋白溶液在室溫或4℃孵育4 h，并不斷攪拌，再經過沉淀分離蛋白溶液和填料）和動態結合、樣品蛋白濃度、溶液pH值、溶液離子強度等分別做了考察。結果發現，僅溶液pH值調整為7.4時可使內毒素含量進一步下降50%，其他條件的改變均沒有明顯提高內毒素去除的程度，未達到預期結果。

2.2 納濾法

如表2所示，在第一組實驗中，含有250 EU/mL內毒素的蛋白溶液（蛋白濃度33.24 mg/mL）經納濾過濾后，內毒素含量下降了89%，不弱于使用Pierce內毒素去除填料的效果。在過濾過程中，20 nm濾器出現堵塞現象，跨膜壓力差大幅增加，可能是內毒素在膜前蓄積造成膜的堵塞。這種現象在內毒素含量低的蛋白料液過濾中沒有發生，因此判斷不是由于單抗分子造成的。第二組實驗在納濾膜包的上游安裝了配套的前濾器，其性質是一種帶正電荷的深層濾器，可以攔截顆粒狀物質，增加納濾膜包的處理量。在加裝了深層預過濾器的納濾中，總體內毒素去除也達到88%，與沒有預過濾器的情況一致，但料液處理量大幅增加，由每平方米納濾膜41.6 g蛋白提高到874.8 g，達21倍。

2.3 氨基酸清洗法

Ritzen等報道，將單抗結合在蛋白A柱上后，可以通過精氨酸溶液沖洗，去除混雜在抗體中的內毒素[10]。精氨酸沖洗去除內毒素的機理尚不清楚，但其殘基帶正電，可能利用電荷作用將內毒素與帶正電荷蛋白質分開，達到去除的效果。

蛋白A柱廣泛用于單抗純化，方便進行工藝放大。蛋白A柱結合精氨酸沖洗的方法分別用26和800 mL等2個規格進行了去除內毒素的研究。在精氨酸作用的同時，也考察了另一帶正電的氨基酸，即組氨酸對內毒素去除的作用。

單抗按照35 mg/mL動態載量結合在蛋白A柱上，用10個柱體積的0～0.5 mol/L精氨酸溶液梯度沖洗層析柱，并接續使用6倍柱體積的0.5 mol/L精氨酸溶液沖洗，在20倍柱體積的柱平衡液沖洗充分去除殘留精氨酸之后，將單抗蛋白洗脫。結果顯示，在0.5 mol/L精氨酸梯度沖洗過程中，精氨酸在150 mmol/L水平即可洗脫大量內毒素（50～100 EU/mL）（圖1A）。內毒素的洗脫在后續梯度及6個柱體積的沖洗中一直持續，并略有降低（最低為2.5～25 EU/mL）。精氨酸溶液之后的柱平衡液（20 mmol/L Tris/100 mmol/L NaCl，pH7.4）沖洗僅能獲得很低的內毒素濃度（2.5 EU/mL），可見精氨酸溶液的作用在沖洗過程中持續存在。最終單抗洗脫液的內毒素含量下降至 3～6 EU/mL（0.2～0.3 EU/mg）（表 3），優于內毒素去除填料和納濾的方法。結果也提示，若增大精氨酸溶液沖洗的體積，單抗洗脫液中的內毒素含量有可能進一步降低。

組氨酸溶液洗脫結果（圖1B）與精氨酸溶液相似。用10個柱體積的組氨酸溶液的0～0.3 mol/L梯度沖洗，隨后進行10個柱體積的0.5 mol/L沖洗。結果顯示，0.3 mol/L組氨酸溶液即已將大部分內毒素去除，單抗洗脫液的內毒素達到3～4.5 EU/mL（0.2～0.3 EU/mg）的最終濃度（表3）。因0.5 mol/L組氨酸在pH7.4時發生鹽析，本實驗中的組氨酸溶液pH值為6.3。與精氨酸相比，組氨酸相對較低的濃度和相對較小的沖洗體積可取得相似的內毒素去除效果。

用5 cm層析柱、800 mL裝柱量的條件下，精氨酸沖洗可以獲得和小規模實驗一致的結果，并在4個循環中表現出很好的重復性，均有97%的去除效果（表3）。因此可初步認為，用蛋白A柱/氨基酸溶液沖洗的方法可以顯著去除單抗中的內毒素，工藝可以有效放大。

表1 Pierce填料去除單抗溶液中的內毒素

表3 蛋白A柱結合氨基酸溶液沖洗去除單抗溶液中的內毒素

圖1 氨基酸溶液沖洗連接在蛋白A柱上的單抗

因單抗與蛋白A柱結合對溶液電導不敏感，使用0.5 mol/L的2種氨基酸溶液均沒有導致單抗與蛋白A柱的脫離，從而保持單抗的高回收率（數據未示）。組氨酸和精氨酸作為天然氨基酸，對單抗分子沒有影響，對人體也不存在毒性。相比于其他一些需要添加物的內毒素去除方法，添加物如表面活性劑等都會給產品及后續純化工藝帶來各種問題[6]。

3 討論

Pierce內毒素去除填料中的多聚賴氨酸配基在中性pH值條件下帶正電荷，以離子交換的形式與內毒素結合[8]。目標單抗pI為pH8～9，這樣帶正電荷的蛋白質在陽離子交換柱中會有與層析介質競爭內毒素的現象[5]。因此，用單純的離子交換法去除帶正電荷的蛋白質溶液中的少量內毒素是很困難的[7]。雖然此方法可將內毒素含量從一個較高水平大幅降低，但殘留的少量內毒素通過和蛋白質的相互作用而變得頑固。在本實驗中，堿性的單抗溶液內毒素含量降低至5 EU/mL水平之后，便很難進一步降低。

Pierce內毒素去除填料可以裝柱進行層析操作，有規模放大的潛力。但是，為了獲得有效的作用時間，樣品的上樣速度緩慢（重力流穿），這就大大增加了污染的風險，導致實際操作性差。

內毒素的結構包親水特異性多糖區和疏水類脂A區，在水溶液中易形成聚合物[5]。內毒素的這種分子復合體形成雙層膜狀結構，體積和分子都很大，在很多應用中可以利用這一特征將其去除，例如超濾法[9]。單抗相對分子質量達150×103，一般不認為可以有效地通過分子質量的區分將兩者分開。但是，在本實驗中觀察到，經過納濾的單抗溶液內毒素含量顯著降低，提示大量的內毒素是以超過納濾孔徑20 nm的復合體形式存在的。

納濾前濾器在去除內毒素中的作用不清楚。因其帶電特性，可能通過離子交換實現一定程度的結合內毒素的功能[4]。實驗結果顯示，在有納濾預過濾器的情況下，納濾的處理量大幅提高，提示大量內毒素可能因為滯留在預過濾器中，沒有過早地堵塞納濾膜包。納濾膜包價格昂貴，且容易堵塞。鑒于在實驗中觀察到深層濾器可能有巨大的去除內毒素的能力，單獨使用深層濾器將溶液中內毒素降低將是較好的選擇，值得進一步探討。

納濾膜包和前濾器組合本是單抗純化工藝中去除病毒的裝置。其對蛋白結合很少，可以保證較高的收率（＞90%）。在本實驗中，6 L單抗溶液在2 h內完成過濾，而且對單抗蛋白濃度、溶液pH值和電導等參數均無超出常規除病毒過濾工藝的特殊要求，非常適合處理中試或以上規模的單抗溶液。

納濾雖然可以去除形成聚合體的內毒素，但在蛋白溶液中，很多內毒素還是以單體形式存在的，并與蛋白質形成復合物，無法通過過濾的方法去除。納濾之后的12.5～25 EU/mL的內毒素，還需要采取其他方法進一步去除。

從滿足工藝放大的條件上看，使用柱層析方法去除內毒素是最方便的[12]。相比較內毒素與固定相結合的動力學特征，將單抗結合在層析柱上而使用不同的流動相洗去內毒素似乎更加方便。在用氨基酸溶液沖洗去除內毒素的實驗中，測試的2個氨基酸雖然都帶有正電荷，但其去除內毒素的原理未必相同。組氨酸作為配體被連接在層析基質上，作為除內毒素的介質早已商業化[13]。Petsch等認為組氨酸可以結合內毒素需要在pH＜5的條件下，因為組氨酸殘基上的咪唑基團pK=6.0[14]。但是，本實驗中使用的pH6.3的組氨酸溶液可以有效洗脫內毒素，而這個條件下組氨酸的咪唑基團并不帶電。有必要在后續工作中摸索氨基酸洗脫內毒素的最佳條件，如組氨酸溶液去除內毒素和pH值的關系，以及組氨酸和精氨酸搭配使用的效果。

比較本實驗中考察的3種方法，內毒素去除填料價格高，操作時間長，內毒素去除較不徹底；納濾法雖然適合中試水平單抗產品的內毒素去除，但仍不能充分降低殘留內毒素水平；而氨基酸清洗法可以有效地進行工藝放大，層析操作方便，且可將內毒素殘留量降至0.25 EU/mg水平，達到中國藥典的要求。將這一步驟整合入單抗純化工藝中，將有助于對純化產品中的內毒素水平進行控制。

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