子宮內膜異位癥中hMLH1、hMSH2基因啟動子區的甲基化研究

單莉莉，朱婷，王中海

廣東醫學院 附屬南山醫院，廣東 深圳 518052

子宮內膜異位癥簡稱內異癥，是婦科常見疾病，常導致痛經、不孕等癥狀，嚴重影響女性身心健康。錯配修復基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）與錯配修復基因2（human mutS homolog 2，hMSH2）是人類細胞內錯配修復系統（mismatch repair system，MMR）的重要組成基因，它們擔負對錯配位點的識別和切除的主要功能。我們應用甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation specific PCR，MSP），檢測了卵巢子宮內膜異位癥組織和正常子宮內膜中hMLH1、hMSH2基因啟動子區的甲基化情況，并分析了其與內異癥的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

我院收治的卵巢子宮內膜異位癥患者23例，所有患者術前未經激素治療，采集異位內膜組織；20例在我院行節育術、子宮脫垂手術的患者，所有患者均排除了患有其他器官系統惡性腫瘤的可能，留取正常子宮內膜組織。所有標本無菌采集后立即置-80℃恒溫冰箱中待用。

1.2 DNA提取

用小量組織基因組DNA抽提試劑盒（購自上海生工公司）提取組織DNA，紫外分光光度計定量，提取的DNA置-20℃保存。

1.3 hMLH1、hMSH2基因啟動子甲基化的檢測

MSP是近年發展起來的一種特異、靈敏的檢測基因甲基化的技術。其原理是，利用亞硫酸鹽可使DNA中胞嘧啶（C）脫氨而轉變為尿嘧啶（U）的特性，將DNA用亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶就轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變。

取 1 μg DNA，用 CpGenome DNA Modifica?tion Kit（購自CHEMICON公司）進行甲基化修飾，然后以此為模板，分別用hMLH1甲基化引物與非甲基化引物（hMLH1-M、hMLH1-U）和hMSH2甲基化引物與非甲基化引物（hMSH2-M、hMSH2-U）進行PCR擴增（引物由上海生工公司合成，序列見表1）。50 μL PCR反應體系（BBI公司提供）包括2×PCR Mas?ter混合液 25 μL（含 3.0 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、0.1 U/μL Taq DNA 聚合酶）、hMLH1-M 或hMSH2-M 1 μL、hMLH1-U 或 hMSH2-U 1 μL、DNA模板（DNA濃度為 0.1～1 μg/μL）1 μL、去離子水1 μL。

hMLH1反應條件：95℃預變性5 min，以95℃變性 45 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 30 s循環 35次，72℃延伸5 min。hMSH2反應條件：95℃預變性5min，以95℃變性40 s、55℃退火40 s、72℃延伸40 s循環35次，72℃延伸7 min。

表1 引物及序列

擴增產物經1.7%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外凝膠成像系統下觀察。

1.4 統計學處理

采用SPSS12.0軟件對結果進行統計學分析。

2 結果

用甲基化和未甲基化引物可同時擴增出產物者為部分甲基化，只有甲基化引物擴增出產物者為完全甲基化。

2.1 hMLH1基因的MSP結果

20例正常子宮內膜組織中出現了1例部分甲基化，異常甲基化率為5%（1/20）；23例子宮內膜異位癥組織中出現了4例部分甲基化和5例完全甲基化，異常甲基化率為39%（9/23）。兩者比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2 hMSH2基因的MSP結果

20例正常子宮內膜組織中出現了1例部分甲基化，異常甲基化率為5%（1/20）；23例子宮內膜異位癥組織中出現了2例部分甲基化，異常甲基化率為8%（2/23）。兩者比較，無明顯差異（P＞0.05）。見圖3、4。

3 討論

圖1 子宮內膜異位癥hMLH1基因啟動子區甲基化情況

圖2 正常子宮內膜hMLH1基因啟動子區甲基化情況

圖3 子宮內膜異位癥hMSH2基因啟動子區甲基化情況

圖4 正常子宮內膜hMSH2基因啟動子區甲基化情況

子宮內膜異位癥異位內膜的來源至今尚未闡明，目前闡述發病機制的主要學說包括經血逆流學說、靜脈淋巴播散學說、體腔上皮化生學說、誘導學說、干細胞起源學說、在位內膜決定論等。近年研究認為，內異癥與糖尿病、高血壓等疾病一樣，是多基因多因素共同作用的結果，具有復雜的遺傳特征，也是一種表觀遺傳疾病[1]。

DNA錯配修復系統（MMR系統）是細胞內在核苷酸水平上糾正復制錯誤的重要手段，可以通過校正新合成DNA鏈中錯配的堿基而高效提高正常體細胞抵御突變的能力，常出現在細胞增殖過程中，對保持DNA復制的忠實性和基因組的穩定性起到關鍵作用[2]。MMR基因的改變使得細胞在增殖過程中的錯誤摻入與缺失不能修復，表現為整個基因組不穩定，隨機突變率增高，使一系列靶基因如涉及細胞生長、分化、凋亡及腫瘤轉移等的相關基因改變，從而導致腫瘤的發生、發展。DNA甲基化指在DNA甲基化轉移酶（DNMT）的催化下，S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基基團被轉移到胞苷嘧啶環的第5位碳原子上，形成甲基化胞嘧啶，哺乳動物中甲基化修飾主要發生在G/C含量豐富的CpG島區域。CpG島被甲基化并結合甲基CpG結合蛋白（MeCP），使基因關閉而抑制基因轉錄。DNA甲基化與基因表達呈反比關系，甲基化程度增高，則基因表達降低。研究發現，在MMR基因中，以hMLH1和hMSH2的功能最為重要，它們擔負對錯配位點的識別和切除的主要功能。hMLH1位于染色體3p21.3-23，基因組全長58 kb，含2268 bp的開放讀框，有19個外顯子，編碼756個氨基酸殘基。hMSH2定位于染色體2p22-21或2p16-15，基因組全長73 kb，含2727 bp的開放讀框，有16個外顯子，編碼909個氨基酸殘基。

近年，在多種人類惡性腫瘤的研究中發現了hMLH1啟動子區域的異常甲基化[3-5]。子宮內膜異位癥雖是良性疾病，但卻具有類似腫瘤的復發和遠處侵犯的特點。有學者利用激光捕獲顯微切割技術和RT-PCR檢測子宮內膜異位癥的異位內膜、在位內膜及正常子宮內膜中3種甲基化轉移酶的基因表達，結果發現3種甲基化轉移酶基因均過度表達，說明在子宮內膜異位癥中確實存在DNA的異常甲基化[6]。在本研究中，我們采用MSP法同時檢測子宮內膜異位癥組織與正常子宮內膜組織中hMLH1、hMSH2啟動子區的甲基化情況，進行比較性研究，結果顯示，子宮內膜異位癥組織中hMLH1啟動子區甲基化發生率高于正常子宮內膜組織，差異具有統計學意義；在正常內膜與子宮內膜異位病灶之間，hMSH2啟動子區甲基化情況沒有顯著區別。本研究結果提示，hMLH1啟動子區異常甲基化可能是子宮內膜異位癥的病因之一，而hMSH2啟動子區甲基化與子宮內膜異位癥之間不存在顯著聯系。

國外已有學者報道，異常甲基化的基因可作為一種新的癌癥的生物學標志物[7]。Vaissière等[8]報道，定量分析特異性基因的甲基化情況并結合性別可作為識別肺癌的危險因素。Malekzadeh等[9]報道，Rb1和Casp-8啟動子的甲基化狀態可作為膀胱癌的一個預后指標。本研究在DNA水平顯示，與正常子宮內膜相比，子宮內膜異位癥組織存在著hMLH1啟動子區的異常甲基化。那么，在未來，我們能否將hMLH1啟動子區的異常甲基化檢測作為內異癥診斷的指標之一？能否通過檢測hMLH1啟動子區的甲基化情況來預測內異癥的復發？本次實驗只是對子宮內膜異位癥中hMLH1、hMSH2啟動子區甲基化的初步研究，我們尚需要大樣本的實驗來進一步證明上述論斷，需要檢測更多的錯配修復基因來尋找其與內異癥的關系。

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[5]Kim H G,Lee S,Kim D Y,et al.Aberrant methylation of DNA mismatch repair genes in elderly patients with sporadic gastric carcinoma:A comparison with younger patients[J].J Surg Oncol,2010,101(1):28-35.

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