嗜熱芽孢桿菌噬菌體的分離及特征研究

晏愛芬，余麗，林連兵

1.保山學院 資源環境學院，云南 保山 678000；2.昆明理工大學 生物工程技術研究中心，云南 昆明 650224

噬菌體是一類寄生在古生菌和真細菌中的病毒，是體積微小、結構簡單、性質特殊的生命形態。隨著對噬菌體在生物學和醫學領域中地位的認識不斷加深，高溫噬菌體引起了越來越多科研工作者的關注，因為它們不僅可以作為一種模式系統，用于研究地熱區生物的分子生物學及生物化學特性，而且還深刻影響著生物地球化學和生態系統的進化過程，包括遺傳轉換、營養循環、生物種群結構、生物分類、生物進化[1]等。對騰沖熱海嗜熱芽孢桿菌噬菌體的研究，不僅可以了解它們在騰沖熱海中的分布及特征，還有助于豐富我國嗜熱噬菌體資源。

本文報道了分離自騰沖熱海熱泉的一株嗜熱芽孢桿菌噬菌體，我們對其進行了電鏡形態觀察、生理特征初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料

噬菌體分離所用的宿主菌嗜熱芽孢桿菌為本實驗室保存；從云南省騰沖縣熱海熱泉采集水樣及沉積物，室溫保存于無菌的離心管中，采樣點溫度為50～75℃，pH值為7.0～8.0。

高溫菌培養基DSM88[2]，調節pH值為7.5；固體培養基的瓊脂濃度為2%，半固體培養基的瓊脂濃度為1%。

1.2 噬菌體的分離及純化

采用雙層平板法分離嗜熱噬菌體[3]。取20 mL熱泉樣品接種到200 mL DSM88液體培養基中，55℃、200 r/min振蕩過夜，所得培養液經0.22 μm滅菌濾膜過濾除菌后，取100 μL濾液與350 μL培養至對數生長期早期的嗜熱芽孢桿菌混合，室溫靜置10 min后與3 mL半固體培養基混勻，均勻傾倒在DSM88固體平板上，即形成雙層平板；將雙層平板置于密封袋中，55℃培養過夜；肉眼觀察到噬菌斑后，用牙簽挑取單個噬菌斑，溶于DSM88液體培養基中，作為下次感染的病毒儲液感染宿主細胞，經3次純化獲得純噬菌體。

1.3 噬菌體的形態觀察

取純化后的噬菌體（效價為108pfu/mL）10 μL，用一定量的2%醋酸雙氧鈾染色，吸附于230目銅網（噴涂碳膜）上，干燥后用JEOL-TEM1400透射電子顯微鏡觀察。

1.4 最佳感染復數的測定

感染復數（multiplicity of infection，MOI）是指初始感染時加入噬菌體的數量與宿主菌數量的比值，也稱感染倍數。參照Lu等[4]的方法，略有改動。培養宿主菌NHH4至對數前期，用分光光度計測定此時的 D600nm值約為 0.2，相當于 1×108CFU/mL；按照MOI分別為0.01、0.1、1、10和100的比例，加入噬菌體純培養液和宿主菌，加入DSM88培養基使各管總體積相同；在55℃搖床中160 r/min振蕩培養8 h，13 000×g離心10 min，收集上清測定噬菌體滴度；各點均作2份復管培養，取平均值，同時以不加噬菌體的宿主菌和不加宿主菌的噬菌體為對照，以產生最高噬菌體滴度的MOI為最佳感染復數。

1.5 物理因素對噬菌體活性的影響

1.5.1 噬菌體的熱穩定性分析[5]取滴度為2.1×108pfu/mL的噬菌體懸液1 mL，分別置于50、55、60、65℃水浴鍋中，每隔10 min取一次樣，共取5次，測定各溫度梯度下不同時間的噬菌體滴度 。

1.5.2 噬菌體pH穩定性分析[5]取pH值分別為4、5、6、7、7.5、8、9、10、11的DSM88培養基0.99 mL，加入1.5 mL滅菌離心管中，加入0.01 mL滴度為2.1×108pfu/mL的噬菌體懸液，室溫靜置1 h，用DSM88培養基稀釋至1/10，取20 μL與350 μL對數期宿主細胞混合，室溫靜置15 min后測定滴度。

2 結果

2.1 噬菌體的分離和純化

把不同采樣點的富集樣品過濾除菌得到的病毒儲液，與培養至對數期的不同菌株吸附，采用雙層平板法檢測是否有噬菌斑形成。結果NHH4菌株的菌苔可見清新、透明的噬菌斑，直徑2～4 mm（圖1）。反復挑取3次純化噬菌體，在合適的液體培養條件下分離到1株噬菌體能快速裂解宿主菌，使培養液變得澄清，噬菌體滴度較高，一般可達108pfu/mL以上；電鏡觀察，可見形態均一的噬菌體顆粒。

2.2 噬菌體電鏡形態

用滅菌牙簽把雙層平板上的噬菌斑挑到液體培養基中培養24 h，對噬菌體培養液超速離心濃縮，于電鏡下觀察，噬菌體顆粒為二十面體型，直徑為80～100 nm，無尾，未見刺突，衣殼較薄，截面呈六邊形，邊長60～80 nm（圖2）。根據其形態，將感染嗜熱芽孢桿菌NHH4的噬菌體命名為嗜熱芽孢桿菌二十面體噬菌體（thermophilicBacillusicosahedral phage，TBIP1）。

2.3 噬菌體TBIP1的最佳MOI測定

加入噬菌體和宿主菌培養8 h后，宿主菌被充分裂解，培養液變得澄清，計數各測定管中的噬菌體滴度，結果見表1。當MOI為1、0.1和0.01時，噬菌體TBIP1感染其宿主菌NHH4產生的子代噬菌體的滴度較高；當MOI為1.0時，子代噬菌體滴度為1.09×109PFU/mL，在所有MOI中，該產出率最高。因此，確定噬菌體TBIP1感染其宿主嗜熱芽孢桿菌NHH4的最佳MOI為1.0。

圖1 噬菌體在平板上形成的噬菌斑形態

圖2 二十面體噬菌體TBIP1的形態

表1 噬菌體TBIP1的感染復數測定

2.4 物理因素對噬菌體TBIP1活性的影響

2.4.1 溫度對噬菌體活性的影響 宿主菌NHH4在45～65℃可被TBIP1感染，以培養溫度為55℃時獲得的噬菌體滴度最高，培養液中噬菌體滴度可達2.8×108pfu/mL。熱穩定性分析（圖3）表明，TBIP1在55℃最穩定，隨著溫度升高，其存活率降低，65℃處理20 min后噬菌體失活。

2.4.2 pH值對噬菌體活性的影響 pH值的改變對噬菌體TBIP1滴度的影響較大，從圖4可以看出，在pH為5～9時，噬菌體均保持45%以上的活性，尤以pH7.5時滴度最高；隨著pH值的升高，噬菌體TBIP1的活性快速降低，pH11時噬菌體完全失去感染宿主的能力；當pH值降到4時滴度為零。相比之下，TBIP1在較為溫和的pH值環境下有較好的穩定性。

3 討論

高溫噬菌體生活在一類特殊的環境中，對溫度具有很強的耐受力和適應性，它們通過侵染嗜熱細菌而生存繁殖，具有獨特的分子生物學和生物化學特性。噬菌體TBIP1是分離自從騰沖熱海溫泉中得到的嗜熱芽孢桿菌NHH4的一株新的烈性噬菌體。TBIP1在DSM88培養基中能夠很好地感染宿主菌NHH4并形成清晰的噬菌斑，感染宿主菌的溫度范圍為45～65℃，最適感染溫度為55℃；感染宿主菌的pH值范圍為5.0～10.0，最適感染pH值為7.5。根據對噬菌體TBIP1的生物學特征分析，認為噬菌體TBIP1比較典型。

騰沖熱海作為我國著名的火山地熱區，具有不同水化學特征的溫泉類型，與之對應的漫長的微生物生態系統的演化，孕育出了現代騰沖熱海豐富的高溫微生物資源。已從騰沖熱海中分離到硫化葉菌噬菌體[6]、棲熱菌噬菌體[5]，可見騰沖熱海的嗜熱菌及其噬菌體都具有生物多樣性。騰沖熱海作為我國重要的高溫菌及其嗜熱噬菌體資源寶庫，值得進一步研究。

圖3 溫度對噬菌體TBIP1活性的影響

圖4 不同pH值對噬菌體TBIP1活性的影響

[1]Fuhrman J A.Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects[J].Natue,1999,399:541-548.

[2]Chen C,Lin L,Qian P,et al.Meiothermus rosaceus sp.nov.isolated from Tengchong hotspring in Yunnan,China[J].FEMS Microbiol Lett,2002,216:263-268.

[3]Martha R J,Clokie A M K.Bacteriophages:methods and pro?tocols,Volume 1:Isolation,characterization,and interactions[M].Humana Press,2008:28.

[4]Lu Z,Breidt F Jr,Fleming H P,et al.Isolation and charac?terization of a Lactobacillus plantarum bacteriophage,ΦJL21,from a cucumber fermentation[J].Int J Food Microbiol,2003,84(2):225-235.

[5]洪偉,韓劍,戴欣,等.騰沖熱海一株棲熱菌裂解性噬菌體的分離及其特征[J].微生物學報,2010,50(3):322-327.

[6]Xiang X,Chen L,Huang X,et al.Sulfolobus tenchongensis spindle-shaped rius STSV1:virus-host interactions and genom?ic features[J].Virology,2005,79:8677-8686.