CARP1基因克隆、表達及其泛素連接酶活性的鑒定

張睿 ，蘇文莉 ，孫走南 ，楊益 ，劉京梅 ，何湘

1.遼寧省腫瘤醫院，遼寧 沈陽 110042；2.軍事醫學科學院 疾病預防控制所，北京 100071

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年增加的趨勢。研究大腸癌的發生機制，有助于腫瘤的早期診斷、治療。我們在前期工作中發現，與癌旁組織相比，結腸癌患者組織標本中caspase 8/10相關RING結構域蛋白1（caspase-8/10-associated RING domain protein1，CARP1）基因表達量顯著增高。因此，為了更進一步研究CARP1在不同信號通路的功能，我們克隆了CARP1的全長基因，并構建了其真核表達載體，在293T細胞中進行了瞬時轉染，發現表達的CARP1具有相應的生物學功能，為下一步研究奠定了工作基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

293T細胞、HCT116細胞、大腸桿菌DH5α、真核表達載體pcDNA3-Flag、受體相互作用蛋白1（recep?tor-interacting protein 1，RIP1）表 達 質 粒 Flag-RIP1、泛素表達質粒HA-Ubi由本實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ和cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司；T4DNA快速連接酶購自全氏金公司；蛋白酶體抑制劑MG132購自Sigma公司；螢光素酶活性測定試劑盒購自Promega公司；轉染試劑Vigo?fect購自威格拉斯公司；DMEM培養基購自GIBCO生物公司；胎牛血清為杭州四季青公司產品；Flag抗體購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋生物有限公司；膠內DNA回收試劑盒、大量質粒提取試劑盒、TRIzol試劑和Pfu DNA聚合酶Mix購自北京天根生化科技有限公司；引物合成和測序由奧科公司完成。

1.2 從結腸癌細胞中擴增CARP1基因

參考TRIzol使用說明，從HCT116細胞中提取總RNA。根據CARP1的基因序列（GenBank登錄號：NM_025126.2）和pcDNA3-Flag載體的多克隆位點，選擇BamHⅠ和XhoⅠ作為酶切位點，設計上游引物5'-CGGGATCCatgaaggcgggtgccacgtctatg-3'（劃線部分為BamHⅠ位點）、下游引物5'-CCGCTCGAGtcag?gacttgaacacgtg-3'（劃線部分為XhoⅠ位點），以反轉錄的cDNA為模板，PCR擴增CARP1基因片段。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃90 s，30個循環；72℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，確定分子量正確后，回收目的基因。

1.3 CARP1基因真核表達載體的構建與鑒定

將回收的擴增產物和pcDNA3-Flag質粒分別用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收。將雙酶切的目的基因與pcDNA3-Flag載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，氨芐西林平板培養過夜。挑選候選陽性克隆進行菌落PCR鑒定，提取陽性克隆質粒進行雙酶切鑒定，鑒定后的克隆送奧科公司測序。Myc-CARP1構建采用亞克隆方法，構建至Myc-tag3B載體。

1.4 細胞培養、轉染及免疫印跡分析

HCT116細胞、293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基于CO2細胞培養箱中常規培養。轉染按說明書進行，轉染前24 h將293T細胞接種于6 cm細胞培養板中。將質粒與200 μL生理鹽水混合，再將2 μL Vigofect與200 μL生理鹽水混合，靜置混勻后將兩者輕輕混合，室溫放置15 min，加入培養板中，繼續培養24 h后，用1×PBS洗細胞3次，用裂解液裂解后，加入SDS上樣緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油，2.5% β-巰基乙醇］，沸水浴5 min，離心后取上清進行SDS-PAGE，電泳結束后轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，然后加入稀釋的Flag特異抗體4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，加入稀釋的HRP偶聯的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，暗室中顯影。

1.5 免疫共沉淀分析

質粒Flag-RIP1、HA-Ubi與Myc-CARP1共轉染293細胞，以僅轉染Flag-RIP1、僅轉染Flag-RIP1和HA-Ubi為對照。按上述方法收取細胞，用含2%SDS的細胞裂解液［2%SDS，150 mmol/L NaCl，10 mmol/LTris-HCl（pH8.0），2mmol/LNa3VO4，50 mmol/L NaF，1×蛋白酶體抑制劑］裂解細胞，沸水浴10 min，離心后取上清，加入10倍體積的稀釋緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，1%Triton X-100］，樣品混勻后加入20 μL抗Flag抗體瓊脂糖珠（Sigma公司）進行免疫共沉淀實驗，在4℃冰箱中旋轉孵育2 h，孵育結束后3000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用洗滌緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%NP-40］800 μL重懸，重復3次，最后一次離心沉淀的珠子中加入1×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，利用免疫印跡對蛋白的泛素化進行檢測。

1.6 螢光素酶活性檢測

按照試劑盒說明書進行。細胞接種于24孔板中 ，將 質 粒 pcDNA3-Flag-CARP1（0.1 μg/孔）、NF-κB-luc（0.1 μg/孔）、pRL（0.002 μg/孔）共同轉染293T細胞，18 h后加入10 ng/μL TNFα處理6 h，用PBS洗2次，在每孔中加入100 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，取50 μL測定螢光素酶活性。

2 結果

2.1 人結腸癌細胞系HCT116總RNA的提取

用TRIzol法提取HCT116細胞系總RNA，從圖1中可以看到提取的總RNA有清晰的5S、18S、28S條帶。

2.2 CARP1基因的擴增

以HCT116細胞系的cDNA為模板擴增CARP1基因，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1000 bp左右出現明顯的擴增條帶（圖2），與預期的CARP1基因長度一致。

2.3 重組pcDNA3-Flag-CARP1質粒的構建與鑒定

將雙酶切的pcDNA3-Flag和目的片段CARP1連接，轉入大腸桿菌，克隆長出后，用含氨芐西林的LB培養基進行菌液擴增，并用PCR檢測是否含有CARP1片段。從圖3A中可以看到1、2克隆中有CARP1插入片段；取1號克隆菌液提取質粒，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后在1000 bp左右出現預期條帶（圖3B）。將1號克隆測序，比對發現CARP1測定序列與報道一致。

2.4 pcDNA3-Flag-CARP1在293T細胞中的表達

pcDNA3-Flag空載體和pcDNA3-Flag-CARP1質粒分別轉染293T細胞，培養24 h后收集細胞，用裂解液裂解后經SDS-PAGE分離，Western印跡結果（圖4）顯示，與空載體對照相比，轉染pcDNA3-Flag-CARP1的細胞中在相對分子質量30×103～55×103之間有一條特異性條帶，與預期大小37×103相符，表明pcDNA3-Flag-CARP1在293T細胞中獲得了表達。

圖1 HCT116細胞總RNA的鑒定

圖2 PCR擴增CARP1基因

圖3 重組質粒的PCR（A）及酶切鑒定（B）

2.5 CARP1對RIP1泛素化及NF-κB轉錄活性的影響

從免疫共沉淀結果（圖5A）可以看到，如果不加入CARP1，RIP1可見較弱的泛素化，而加入CARP1后RIP1泛素化明顯增強。有文獻報道，CARP1可以通過泛素化RIP1抑制TNFα激活NF-κB的功能。將pcDNA3-Flag空質?；騪cDNA3-Flag-CARP1和NF-κB-luc及pRL質粒共同轉染細胞，4 h后換液，收細胞前6 h加入10 ng/mL TNFα刺激。從圖5B可以看到，加入TNFα后，NF-κB活性增加了6倍，轉染pcDNA3-Flag-CARP1后，TNFα引起的NF-κB升高的活性被明顯抑制。這些結果提示我們，構建的pcDNA3-Flag-CARP1具有生物學活性。

圖4 Western印跡鑒定CARP1在293T細胞中的表達

圖5 CARP1活性檢測

2.6 CARP1對結腸癌細胞系生長的影響

將pcDNA3-Flag空質粒或pcDNA3-Flag-CARP1分別轉染相同數量的HCT116細胞，在24、48、72、96 h收取細胞計數并做圖（圖6），可以看到CARP1基因促進HCT116細胞的生長（P＜0.05）。順鉑（cisplatin，CDDP）是化療常用藥物，可以抑制腫瘤細胞的生長。從圖6我們可以看到，在細胞中加入CDDP（5 μg/mL），HCT116 細胞的生長受到了明顯抑制；而細胞中過表達CARP1時，CDDP的生長抑制作用減弱（P＜0.01）。進一步說明CARP1促進細胞生長，并可以部分抵抗化療藥物引起的細胞生長抑制作用。

圖6 CARP1基因對細胞生長的影響

3 討論

2004年El-Deiry等報道，CARP1可以泛素化caspase-8和-10，引起這2個蛋白通過蛋白酶體降解，從而抑制caspase-8和-10介導的凋亡[1]。CARP1含有一個RING鋅指結構域，是泛素連接酶常見的結構域。CARP1的RING鋅指結構域與牛小腸堿性磷酸酶（cIAP）結構域的同源性很高，而cIAP不具備降解caspase-8和-10的活性。文獻還報道了CARP1可以泛素化從而降解抑癌基因p53，并降低p53ser20磷酸化水平[2-4]。另外，CARP1還參與到腫瘤壞死因子受體（TNFR）復合物中，通過蛋白酶體途徑降解泛素化的RIP1，從而降低NF-κB的活性[5]。為了研究該基因的功能，我們從HCT116細胞cDNA文庫中克隆了CARP1基因，構建了其真核表達載體pcDNA3-Flag-CARP1，瞬時轉染293T細胞，利用Western印跡證實該表達載體能夠在293T細胞中表達，最后利用體內泛素化實驗及螢光素酶報告基因實驗檢測到構建的CARP1具有相應的生物學功能。另外，實驗中還發現在HCT116中過表達CARP1可以促進HCT116細胞的增殖，并可部分抵抗順鉑引起的生長抑制，但機制并不清楚。以上結果說明CARP1可能參與腫瘤的發生、發展及耐藥性的產生，為我們進一步研究CARP1的功能奠定了基礎。

[1]McDonald E R,El-Deiry W S.Suppression of caspase-8-and-10-associated RING proteins results in sensitization to death ligandsand inhibition oftumorcellgrowth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:6170-6175.

[2]Yang W,Rozan L M,McDonaldⅢE R,et al.CARPs are ubiquitin ligasesthatpromoteMDM2-independentp53 and phospho-p53ser20degradation[J].J Biol Chem,2007,282:3273-3281.

[3]Yang W,Dicker D T,Chen J,et al.CARPs enhance p53 turnover by degrading 14-3-3sigma and stabilizing MDM2[J].Cell Cycle,2008,7(5):670-682.

[4]Yang W,El-Deiry W S.CARPs are E3 ligases that target apicalcaspases and p53[J].CancerBiolTher,2007,6(11):1676-1683.

[5]Liao W,Fujita K I,Xiao Q,et al.CARP1 regulates induc?tion of NF-κB by TNFα[J].Curr Biol,2009,19(1):R17-R18.

[6]Liao W,Xiao Q,Tchikov V,et al.CARP-2 is an endo?some-associated ubiquitin ligase for RIP and regulates TNF-induced NF-κB activation[J].Curr Biol,2008,18(9):641-649.