miR-455慢病毒表達載體的構建與鑒定

張康 ，梅倩 ，李祥 ，趙亞力 ，韓為東 ，孟元光

解放軍總醫院 a.婦產科；b.基礎醫學所分子生物室；北京 100853

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年研究較為廣泛的一類小分子非編碼調控的內源性單鏈RNA，由19～25個核苷酸組成，通過與mRNA的3'非翻譯區結合，降解mRNA或抑制其翻譯，使基因在轉錄后水平產生沉默，調控基因表達[1]。目前，人類基因組中已確認數以千計的miRNA，可能參與人類30%的蛋白質的表達調控，對細胞周期調節、細胞生長、發育、凋亡、代謝、應激反應及腫瘤發生發展等過程都有重要的作用[2-5]。隨著越來越多新的miRNA及其功能的不斷發現，miRNA作為生物體重要的基因調控分子，與疾病的關系尤其是與腫瘤的關系成為生物醫學領域研究的熱點。

目前，研究miRNA功能多采用人工合成miRNA擬似物或拮抗物，但其作用時間短，難以適應腫瘤等漸進性疾病的研究。作為真核生物細胞基因轉移的載體系統之一，人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）來源的慢病毒載體越來越受到重視[6]。本研究旨在針對miRNA-455（miR-455）開展慢病毒質粒載體的構建研究，以探討miR-455在宮頸癌中的作用機制和利用慢病毒進行基因治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞株SiHa、病毒包裝細胞293T（本實驗室保存，為貼壁細胞）；大腸桿菌TOP10（天根生化公司）；MEM培養基、胎牛血清（Gibco公司）；慢病毒表達載體pWPT-GFP、輔助包裝原件載體pMD2G和 pSPAX2（本實驗室保存）（圖 1）；TRIzol試劑、Li?pofetAMINE2000（Invitrogen公 司）；SYBR Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）；限制性核酸內切酶BamHⅠ、MluⅠ及T4DNA連接酶（NEB公司）；D2000 DNA marker（大連寶生物工程公司）；小量質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒（SBS公司）；質粒大提試劑盒（QIAGEN公司）。

1.2 PCR擴增pri-miR-455

通過EMBL數據庫獲得has-miR-455初始形式（pri-miR-455）的序列，應用Primer 5.0軟件設計引物并由Invitrogen公司合成（引物F：5'CGGGATCCT GGCACAATGTTGGCAC3'；引 物 R：5'CGACGCGTG AAGCAAACTTACTCGT3'，上下游引物分別含有BamHⅠ和MluⅠ酶切位點）；以正常人基因組DNA為模板擴增，反應程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環，每管 20 μL體系；純化并回收PCR產物。

1.3 miR-455慢病毒質粒的構建

圖1 pWPT-GFP質粒圖譜

PCR擴增pri-miR-455，載體質粒為pWPTGFP，酶切位點為BamHⅠ和MluⅠ，酶切4 h使其線性化后，以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定比例，確定連接比例，進行連接。酶切回收載體DNA（100 ng/μL）1 μL，退火雙鏈 DNA（100 ng/μL）6 μL，10×T4噬菌體DNA 連接酶緩沖 液 2 μL，T4DNA 連 接 酶 1 μL，ddH2O 10 μL，16℃連接過夜，轉化細菌。陽性克隆PCR鑒定：上、下游引物各0.5 μL，2×Tap PCR Mas?ter Mix 10 μL，菌落裂解液 1 μL（陽性對照組不加，陰性對照組加水），由ddH2O配置反應體系為20 μL。PCR反應條件：94℃熱啟動30 s；94℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸30 s,30個循環，72℃聚合6 min。分別挑選3個序列的陽性克隆送華大基因公司測序鑒定。

1.4 質粒抽提

用QIAGEN公司試劑盒抽提3種質粒，參照試劑盒說明書進行。

1.5 慢病毒重組體的包裝、感染

胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，以5×105接種于細胞培養皿中，于37℃、5%CO2培養箱內培養，細胞密度達70%～80%時進行轉染。測序鑒定正確的重組質粒pWPT-GFP-pri-miR-455及2種輔助包裝原件載體質粒 pSPAX2、pMD2G，按照 4∶2∶1的比例混合，用LipofetAMINE2000共轉染到293T細胞，轉染5 h后更換正常培養基繼續培養，48、72 h后分別收集培養上清，感染未轉染的SiHa細胞。

1.6 Real-time定量PCR檢測慢病毒感染后miR-455的表達

小量包裝獲得的慢病毒轉染宮頸癌SiHa細胞，感染3 d后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達，若感染率低于50%則重新轉染；若感染率超過50%，待感染5 d后，選擇3～5個視野/孔，在熒光顯微鏡下觀察發綠色熒光細胞的平均數與總細胞平均數的比值，估計質粒的轉染效率。收集細胞，用Real-time定量PCR方法檢測miR-455的表達，進而判斷病毒的感染效率。PCR方法同上。定量數值采用2-ΔΔCt方法計算。每組重復3次實驗。

1.7 統計學方法

所有實驗結果用SPSS 13.0進行統計學分析，采用配對t檢驗，P＜0.05示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pri-miR-455的擴增

以基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到大小為550 bp的片段（圖2），DNA測序證明擴增片段的核苷酸序列與GenBank中的pri-miR-455序列完全一致（序列未示）。

2.2 pWPT-GFP-pri-miR-455重組質粒的陽性克隆鑒定

pWPT-GFP-pri-miR-455重組質粒陽性克隆的PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳見圖3，經測序，1～8號均正確。

2.3 質粒pWPT-GFP-pri-miR-455對293T細胞的轉導效率

圖2 pri-miR-455 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

先鑒定構建的質粒對293T細胞的轉染效率，轉染效率在90%以上（圖4A）；以2-ΔΔCt分析法計算，轉染48 h后miR-455的表達量提高了37.1倍（圖4B）。

2.4 慢病毒對SiHa細胞的感染效率

先鑒定構建的慢病毒上清對SiHa細胞的轉導效率，感染效率在90%以上（圖5A）；以2-ΔΔCt分析法計算，病毒感染后miR-455的表達量上調近40倍（圖5B）。

3 討論

miRNA作為一類具有基因表達調節作用的小分子，參與各種生物體的生理和病理功能[7]，約30%的蛋白編碼基因受其調控[8]，其功能研究是近年來人們一直關注的話題。

圖3 載體pWPT-GFP-pri-miR-455的測序結果

圖4 質粒pWPT-GFP-pri-miR-455對293T細胞的轉染效率

圖5 慢病毒上清對SiHa細胞的感染效率

目前研究miRNA功能及機制的方法較多，但大致分為過表達或抑制表達兩種方式。過表達研究又常選用瞬時轉染或構建表達載體方法。瞬時轉染可將人工合成的miRNA或其靶基因擬似物（mimics）[9]這些短序列，通過轉染方式使其在體內發揮作用。此類方法實施起來方便快捷，但所建立的miRNA功能獲得或缺失的動物模型無法適應長期研究，更無法進行傳代。通過慢病毒包裝技術可解決這一問題，尤其是miRNA在腫瘤發生發展中的作用等研究中，模式動物的建立將會發揮更大作用。

慢病毒載體是以HIV-1為基礎發展起來的新興載體，可以高效感染分裂期及非分裂期細胞，具有方法簡單、目的基因整合率高并長期表達、免疫原性低等優點。此外，慢病毒為“自殺”性病毒，感染目的細胞后不會再感染其他細胞及產生新的病毒顆粒，安全性高，因而是一種強有力的基因運輸工具，已成為當前基因治療中載體研究的熱點。

我們采用分子克隆技術構建了miR-455慢病毒表達載體，并建立了基于SiHa細胞的高效轉染系統，為進一步鑒定miR-455在宮頸癌中的作用靶點及對其進行功能研究提供了有力支持。

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