基于Tet-On Advanced的肺癌細胞15-脂氧化酶-2基因表達載體的構建與表達

楊玉花 ，魏曉莉 ，鄭建全

1.軍事醫學科學院 毒物藥物研究所，北京 100850；2.中國航天員科研訓練中心，北京 100094

脂氧化酶（lipoxygenase，LOX）是哺乳細胞內參與花生四烯酸代謝通路的重要酶類，可催化氧分子添加至花生四烯酸和多不飽和脂肪酸，產生氫過氧化衍生物，進一步生成各類花生酸物質[1]。15-LOX催化氧分子插入其底物的C13或15位，存在2種亞型，即15-LOX-1和15-LOX-2。脂氧化酶代謝通路廣泛參與人體代謝調節，調控細胞增殖、凋亡、分化和衰老，特別是在腫瘤發生和進展中有重要的調節作用。近年來，靶向脂氧化酶的抗癌作用研究已成為熱點。15-LOX-2在許多腫瘤中表達下調或缺失，可能作為抑癌基因參與細胞生長的調節[2-3]。在抗癌作用研究中，須將15-LOX-2基因過表達或抑表達，但以往的研究都不具備時空可控性，從而在解決腫瘤問題時，給15-LOX-2的功能研究帶來了一定的困難。

Gossen等[4-5]建立的四環素基因表達調控系統（Tet-On/Tet-Off系統）高效無毒、具有嚴密的開/關功能。其中，Tet-On系統為四環素正向調節的基因表達系統，是一種可誘導性的基因表達調控系統，當有四環素的衍生物強力霉素（doxycline，DOX）存在時，可誘導插入啟動子下游的目的基因高效表達，而撤走藥物時基因一般不被轉錄[6]。對于15-LOX-2基因表達調控的研究，該系統顯得十分便利。

肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因之一，其發病率和致亡率居各種惡性腫瘤之首[3，7]，而其傳統治療方式只能提供有限的成功。因此，改進肺癌治療效果的相關研究是非常急迫和至關重要的。為此，我們選用人肺癌細胞株A549，采用Tet-On Ad?vanced系統的pTRE-Tight載體，構建了時空表達可控的pTRE-Tight-15-LOX-2表達載體，為深入研究脂氧化酶信號通路與腫瘤的關系打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

肺腺癌細胞A549由本研究所四室惠贈；感受態大腸桿菌TOP10、DNA marker購自北京博邁德生物公司；15-LOX-2載體質粒pcDNA3-15-LOX-2由海德堡德國癌癥研究中心Peter Krieg博士惠贈；Tet-On Advanced Inducible Gene Expression Sys?tems（pTet-On-Advanced、pTRE-Tight、pTRE-Tight-Luc）購自Clontech公司；限制性內切酶（EcoRⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、BamHⅠ）、DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒、Luciferase Assay System為Promega公司產品；瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒購自北京蓋寧金諾生物公司；Lipo?fectAMINE 2000購自Invitrogen公司；兔抗15-LOX-2抗體購自Cayman公司；小鼠抗β-Actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗兔抗體、HRP標記的抗鼠抗體購自中山金橋公司；Pro-light HRP化學發光檢測試劑購自天根生化公司。

1.2 線性化15-LOX-2 cDNA的制備

將質粒pcDNA3-15-LOX-2轉化感受態大腸桿菌TOP10，擴增含質粒細菌，用質粒小提試劑盒提取15-LOX-2 cDNA，用內切酶EcoRⅠ、XbaⅠ對15-LOX-2 cDNA進行雙酶切，電泳驗證片段大小。

1.3 pTRE-Tight-15-LOX-2的構建

將質粒pTRE-Tight用內切酶EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，電泳驗證片段大小，用瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒將pcDNA3-15-LOX-2和pTRETight雙酶切電泳驗證產物切膠回收后，用DNA連接試劑盒連接，構建重組質粒pTRE-Tight-15-LOX-2，轉化TOP10感受態細菌后，挑單克隆擴大培養，提取質粒，EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定。

1.4 細胞培養

肺腺癌細胞系A549常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中，在37℃、5%CO2條件下培養。

1.5 實驗分組

1.5.1 pTet-On-Advanced、pTRE-Tight-Luc共轉染載體比例篩選 分3個比例組，即1∶1、1∶5和5∶1，每個比例含2組細胞，一組不加DOX作為對照，另一組加入DOX誘導螢光素酶表達。

1.5.2 pTet-On-Advanced與pTRE-Tight-15-Lox-2共轉染 分3組，即空白對照組、添加DOX組和不加DOX組。

1.6 LipofectAMINE 2000轉染及DOX誘導

經過24 h培養，將A549細胞培養至90%～95%的融合度時，按LipofectAMINE 2000轉染說明書，將質粒轉染到A549細胞中去，轉染5 h后加入DOX誘導，24 h后檢測。

1.7 螢光素酶活性檢測

按Luciferase Assay System說明書的方法，吸掉培養基，用PBS洗96孔板中待分析的細胞2次，完全吸走PBS，每孔加入25 μL 1×PLB，放搖床上室溫輕搖 15～30 min，收集細胞裂解液，每個樣品取 10 μL蛋白裂解液，加入50 μL Luciferase Assay Reagent，用螢光素酶檢測儀檢測螢光素酶活力，計算誘導倍數（誘導倍數=加DOX組活力/不加DOX組活力）。

1.8 Western印跡檢測A549細胞中15-LOX-2的表達

經DOX誘導24 h后，收集細胞于1.5 mL EP管，加入0.1 mL預冷的細胞裂解液［50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150mmol/L NaCl，1% NP40，0.1%SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，臨用前加入蛋白酶抑制劑混合物］，于冰上裂解30 min，40℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清即為細胞總蛋白。采用BCA Protein Assay試劑盒定量。取40 μg蛋白加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min后進行SDS-PAGE分離（分離膠濃度為8%），轉PVDF膜后用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉l h，加稀釋的一抗抗體（1∶1500）雜交（4℃過夜），PBST洗膜后加入HRP偶聯的二抗作用50 min，暗室內加入增強化學發光試劑，X線膠片顯影。

2 結果

2.1 pTRE-Tight-15-Lox-2載體的構建

pcDNA3-15-LOX-2和pTRE-Tight載體分別用EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在2040和2512 bp位置出現明顯的條帶（圖1），與目的條帶大小相符，為15-LOX-2基因和pTRE-Tight載體的正確連接準備好了條件。

將pcDNA3-15-LOX-2和pTRE-Tight載體經EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切的目的條帶切膠回收連接，產物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，在氨芐西林抗性（Amp+）的LB培養基平板上挑取白色單個菌落，振蕩培養，小量提取質粒經EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切，酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳（圖2），在pTRETight-15-Lox-2雙酶切后孔帶上可觀察到2040和2512 bp的目的基因片段條帶，表明克隆得到正確的含有目的基因片段的原核表達質粒。

2.2 pTet-On-Advanced、pTRE-Tight-Luc共轉染載體比例的篩選

用 LipofectAMINE 2000轉染體系，在96孔板上用質粒pTet-On-Advanced和pTRE-Tight-Luc共轉染2個復孔細胞，采用不同的Tet-On/TRE載體比例（1∶1、1∶5、5∶1），結果顯示1∶1的載體比例經DOX誘導的螢光素酶表達活性最高（圖3），誘導倍數為432（圖4），為15-LOX-2的誘導表達提供了轉染的載體比例依據。

2.3 DOX誘導pTRE-Tight-15-LOX-2在肺癌細胞中的表達

圖1 質粒EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

圖2 重組質粒pTRE-Tight-15-LOX-2雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

為驗證pTet-On-Advanced與pTRE-Tight-15-Lox-2共轉染A549細胞后，DOX對15-LOX-2的誘導表達效果，即檢驗重組質粒pTRE-Tight-15-LOX-2的表達情況，我們采用上述1∶1的共轉染載體比例，在DOX誘導24 h后收集細胞，用Western印跡檢測了A549細胞中15-LOX-2的表達。結果顯示，DOX誘導24 h后，空白對照組、未加DOX組均未檢測到15-LOX-2的表達，而添加DOX組檢測到15-LOX-2的表達（圖5）。這表明經DOX誘導后，15-LOX-2能在肺癌細胞內表達，且在未加入DOX時基礎表達極低。

3 討論

Tet-On Advanced可誘導基因表達系統是一個嚴密、高效的反應系統，能在靶細胞里使目標基因按需強烈表達。四環素控制的反式作用因子Tet-On Advanced是一個融合蛋白，由大腸桿菌四環素反應蛋白的突變體結合于單純皰疹病毒（herpes sim?plex virus，HSV）VP16蛋白的3個小的轉錄活化區組成。當有誘導劑DOX存在時，Tet-On Advanced結合到PTight的四環素反應元件（TREMOD），引起下游目的基因的高水平轉錄。

圖3 pTet-On-Advanced和pTRE-Tight-Luc共轉染A549細胞后的螢光素酶活性

圖4 pTet-On-Advanced和pTRE-Tight-Luc共轉染A549細胞后的螢光素酶誘導表達倍數

圖5 Western印跡檢測DOX誘導后15-LOX-2的表達

近年來陸續有運用四環素調控系統進行藥物篩選和抗癌機制及基因治療方面的研究報道[8-9]。尤其在抗癌藥物作用機制研究中，某些基因具有抗癌效應，給基因的表達調控研究帶來了一定的困難。而Tet-On Advanced系統能在需要時誘導目的基因高效表達，從而在抗癌效應基因的表達調控研究方面具有一定的優勢。

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響人類健康。腺癌的惡性程度較鱗狀細胞癌高，且對其的診斷是更差的[10-11]。對腺癌發生發展機制的較好理解，有助于更好的癌癥治療項目的發展。A549細胞是人肺腺癌細胞，具有非整倍性的特性，同時還易轉移，對化療藥物不敏感。

對包括肺腺癌在內的肺癌的基因治療是當前研究的熱點，有望成為繼手術治療、化療及放療后的一種新的治療模式。研究表明，15-LOX-2不僅可抑制腫瘤細胞生長，還可誘導多種腫瘤細胞凋亡。實際上15-LOX-2為表皮型15-LOX，于1997年由Brash等從人的發根克隆得到，主要表達于皮膚、前列腺、肺和角膜，主要代謝花生四烯酸產生15-羥二十碳四烯酸（15-S-HETE）。Kelavkar等的研究顯示，15-LOX基因位于染色體17p13.3，緊鄰人p53腫瘤抑制基因。15-LOX基因產物可能是抗炎分子和細胞膜重塑的調節者，也可能是一種潛在的腫瘤抑制分子[12]。有研究者認為15-LOX-2在乳腺癌、胰腺癌和結腸癌中都具有抑癌活性[2-3]，但其對肺癌尤其是肺腺癌A549細胞的作用及分子機制尚不清楚。

我們在基因水平上構建了pTRE-Tight-15-Lox-2誘導表達載體，與調控載體pTet-On-Ad?vanced共轉染A549細胞。實驗結果顯示，加入DOX后能夠誘導15-LOX-2表達，且在未加入DOX時基礎表達極低（未檢測到）。本研究結果表明Tet-On Advanced能嚴密有效地調控15-LOX-2的表達，為研究15-LOX-2與肺癌的關系打下了基礎。

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