血管內皮細胞生長因子啟動子突變體螢光素酶報告基因載體的構建

張述 ，劉婕 ，劉世翠 ，林婭紅 ，3，張亞楠 ，丁麗華 ，葉棋濃

1.廈門長庚醫院，福建 廈門 361028；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；3.福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002

腫瘤的生長擴增以及向遠處的轉移都與腫瘤血管的生成密切相關，如果缺乏毛細血管，移植瘤體的直徑將被限制在0.4 mm左右，腫瘤細胞容易發生壞死或凋亡，控制腫瘤的血管生成可以有效限制腫瘤的生長及侵襲[1]。在腫瘤發展相對較早的階段即開始有血管生成，腫瘤血管的增加與腫瘤的生長、血行轉移及不良預后有著密切的關系[2-3]。腫瘤細胞分泌的許多細胞因子都可以刺激血管生成。在現已發現的促血管生成因子中，血管內皮細胞生長因子（vas?cular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成調節因子，在多種血管生成中起核心調控作用。VEGF在多種腫瘤的生長、侵襲及轉移的多個過程中都發揮著重要作用。VEGF家族有多個成員，其中VEGF-A分布范圍較廣，且作用較大。VEGF-A基因位于染色體6p21.3，全長28 kb，編碼VEGF-A的基因序列約14 kb，啟動子區域約為2400 bp，該啟動子上含有多個轉錄反應元件。對VEGF轉錄具有調控作用的轉錄因子很多，包括激活蛋白 1（activator protein-1，AP-1）、缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）等。HIF-1 是介導腫瘤缺氧適應的關鍵轉錄調控因子，在缺氧環境中表達增加，可使腫瘤細胞耐受缺氧，促進腫瘤生長、浸潤轉移[4-5]。HIF-1是異源二聚體蛋白，由亞基HIF-1α和 HIF-1β組成[6]。HIF-1α的表達與細胞的氧氣濃度相關，在多種腫瘤中，HIF-1α在缺氧條件下轉錄激活VEGF。

VEGF的表達調控主要是在轉錄水平，因此，對VEGF表達的轉錄因子進行深入研究有重要意義。我們構建了含VEGF啟動子不同片段的螢光素酶報告基因載體，檢測了不同片段報告基因與轉錄因子的結合情況，發現VEGF啟動子的-1128～-728區域可以與HIF-1α結合，并促進VEGF啟動子的轉錄活性。用構建的報告基因載體可篩選新的調控VEGF啟動子活性的轉錄因子，為研究這些調節因子在腫瘤中的作用，尋找治療腫瘤的新靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細胞293T由本實驗室保存，用含10%小牛血清的DMEM培養基于含5%CO2的孵箱內37℃常規培養；大腸桿菌 DH5α為本實驗室保存；pGL4-basic載體、質粒提取試劑盒購自Promega公司；含人全長VEGF啟動子序列的表達載體、HIF-1α真核表達載體由本實驗室保存；LA-Taq酶、dNTP、限制性內切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；DMEM培養基、LipofectAMINE2000轉染試劑購自Invitrogen公司；DNA序列分析由奧科公司完成。

1.2 VEGF啟動子的PCR擴增

根據GenBank中的VEGF啟動子序列（登錄號為AF095785），以VEGF啟動子全長為模板，PCR擴增VEGF啟動子的5'端系列缺失突變體。引物及序列見表1，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.3 重組質粒的構建

上述PCR產物用XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后連接到經同樣酶切處理的pGL4-basic載體中，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒，將PCR鑒定和酶切鑒定陽性的質粒進行序列分析。

表1 引物及序列

1.4 質粒瞬時轉染293T細胞

將293T細胞用DMEM培養基（含10%小牛血清）轉種到24孔板，在37℃、5%CO2條件下培養，24～36 h后轉染，分別將質粒 DNA 和 1.6 μL Lipo?fectAMINE2000溶于50 mL不含血清、抗生素的DMEM培養基中，之后將二者混合，室溫放置20 min后加到24孔細胞板中。

1.5 螢光素酶和α-半乳糖苷酶活性測定

螢光素酶活性測定基本按照Promega公司試劑說明書進行。細胞轉染24 h后棄培養基，用PBS洗1次，在24孔板中每孔加入80 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，將細胞裂解物收集到1.5 mL離心管中，持續振蕩5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清，取10 μL加到25 μL螢光素酶底物中，立即用熒光計測定螢熒光素酶活性。

用ONPG測定α-半乳糖苷酶活性。取上述上清10 μL 與 90 μL Z 緩沖 液/β-巰 基 乙 醇 溶 液（10 mL 16.1 g/L Na2HPO4·H2O，0.75 g/L KCl，0.246 g/L MgSO4·7H2O，27 μL β-巰基乙醇）混合，加入 20 μL 4 mg/mL ONPG，常溫放置，當出現淺黃色時加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，測定樣品的D420nm值。

1.6 Western印跡

轉染后收集細胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進行SDS-PAGE，電轉移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉1∶5000稀釋的Myc抗體或1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.7 不同片段VEGF啟動子報告基因載體活性測定

分 別 將 0.2 μg 質 粒 pGL4-VEGF400、pGL4-VEGF800、 pGL4-VEGF1200、 pGL4-VEGF1597、pGL4-VEGF1982、pGL4-VEGF2377、pGL4-VEGF、pGL4-basic與0.1 μg表達α-半乳糖苷酶的質粒和50 ng空載體XL-5或50 ng HIF-1α質粒共同瞬時轉染293T細胞，24 h后收集細胞，測定螢光素酶和α-半乳糖苷酶活性，其中α-半乳糖苷酶活性用于校正細胞轉染效率。啟動子活性為細胞轉染效率校正后的螢光素酶活性。

2 結果

2.1 VEGF啟動子的PCR擴增

以VEGF啟動子全長為模板，PCR擴增VEGF啟動子的5'端系列缺失突變體，長度分別為2377、1982、1597、1200、800、400 bp，DNA 凝膠電泳結果表明與預期大小相符（圖1）。

2.2 VEGF啟動子報告基因載體的構建

將上述PCR產物用XhoⅠ、HindⅢ雙酶切，克隆到經同樣雙酶切處理的pGL4-basic載體中，抗性篩選得到的重組質粒經PCR鑒定為陽性（結果未示）。酶切鑒定結果進一步表明，該重組質粒有與預期大小相似的插入片段，而空載體中無插入片段（圖2）。DNA序列分析結果證實該插入片段為VEGF啟動子（結果未示）。

2.3 確定VEGF啟動子與HIF-1α相互作用的最主要的轉錄調控區域

對照組空載體XL-5、5'端缺失突變體報告基因載體及VEGF全長啟動子轉染293T細胞后，檢測報告基因的轉錄活性，發現VEGF啟動子本身具有轉錄活性；轉染HIF-1α后，-328～+72、-728～+72 bp區域啟動子轉錄活性沒有明顯升高，而-1128～+72 bp區域啟動子轉錄活性在結合HIF-1α后由182增至385，約升高了2.1倍（P＜0.05）。因此，HIF-1α可能結合在-728～-1128 bp區域（圖3）。通過序列分析，我們發現VEGF啟動子-728～-1128 bp區域存在HIF-1α 結 合 序 列 HRE（HIF-1 response element，TACGTGGG），這與我們的結果是一致的。Western印跡表明，帶Myc標簽的HIF-1α真核表達載體成功表達（圖4）。因此，-1128～+72 bp區域啟動子與HIF-1α表達載體共轉染活性升高是由于啟動子和HIF-1α相互作用引起的。

圖1 VEGF啟動子不同片段的PCR擴增

圖2 pGL3-VEGF不同片段的XhoⅠ和HindⅢ酶切鑒定圖

3 討論

VEGF在腫瘤血管生成中起核心作用，因此，抗VEGF信號通路治療成為研究熱點[7-8]。通過阻斷VEGF及其受體導致的血管通透性的增加，可抑制腫瘤的生長。VEGF的表達調控主要發生在轉錄水平，因此，通過轉錄因子對VEGF的轉錄進行調控是最主要的途徑。轉錄因子不僅可直接結合在VEGF的啟動子上促進VEGF的轉錄，而且可通過與生長因子、癌基因和抑癌基因的相互作用發揮調控VEGF表達的功能。因此，對VEGF表達的轉錄因子進行深入研究，有助于闡明腫瘤發生、發展和轉移機理，確立診斷和預后指標，以及開發有效的腫瘤治療藥物。

我們所克隆的VEGF-A啟動子全長序列是細胞中天然存在的。VEGF全長啟動子及5'端缺失突變體報告基因分析表明，VEGF啟動子-328～+72 bp區具有最高的轉錄活性，這與已報道的結果一致；-328～+72 bp區域是VEGF轉錄因子Sp1、AP2、Egr-1等的結合位點。應用VEGF全長啟動子及5'端缺失突變體報告基因與HIF-1α共轉染，發現HIF-1α結合在VEGF啟動子-718～-1128 bp區域，通過序列分析，我們發現此區域存在HRE序列[9-10]。VEGF全長啟動子及5'端缺失突變體報告基因載體的構建，為進行轉錄活性測定實驗、研究其他轉錄因子與VEGF啟動子的相互作用及其相互作用的區域、篩選新的針對腫瘤血管生成相關的治療靶點奠定了良好的基礎。

圖3 VEGF啟動子不同片段與HIF-1α相互作用的轉錄活性測定

圖4 Western印跡鑒定HIF-1α在293T細胞中的表達

[1]Hanahan D,Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis[J].Cell,1996,86(3):353-364.

[2]Vamesu S.Angiogenesis and tumor histologic type in primary breast cancer patients:an analysis of 155 needle core biopsies[J].Rom J Morphol Embryol,2008,49(6):181-188.

[3]Vermeulen P B,van Golen K L,Dirix L Y,et al.Angiogene?sis,lymphangiogenesis,growth pattern,and tumor emboli in in?flammatory breast cancer:a review of the current knowledge[J].Cancer,2010,116:2748-2754.

[4]Cascio S,D'Andrea A,Ferla R,et al.miR-20b modulates VEGF expression by targeting H IF-1 alpha and STAT3 in mcf-7 breastcancercells[J].J CellPhysiol,2010,224(1):242-249.

[5]Kim S E,Shirm K N,Jung S A,et al.The clinic pathologi?cal significanceof tissuelevelsof hypoxia-induciblefactor 1alpha and vascular endothelia l growth factor in gastric can?cer[J].Gut Liver,2009,3(2):88-94.

[6]Holmquist L,Lofstedt T,Pahlman S,et al.Effect of hypoxia on the tumor phenotype:the neuroblastoma and breast cancer models[J].Adv Exp Med Biol,2006,587(4):179-193.

[7]Zhang J,Lu A,Beech D,et al.Suppression of breast cancer metastasis through the inhibition of VEGF-mediated tumor an?giogenesis[J].Cancer Ther,2007,5(2):273-286.

[8]Xie K P,Wei D Y,Shi Q,et al.Constitutive and inducible expression and regulation of vascular endothelial growth factor[J].Cytokine Growth Factor Rev,2004,15(5):297-324.

[9]Park S Y,Jiang W J,Yi E Y,et al.Melaton in suppresses tumor angiogenesis by inhibiting HIF-1 alpha stabilization un?der hypoxia[J].J Pineal Res,2010,48(2):178-184.

[10]Grimshaw M J.Endothelins and hypoxia-inducible factor in cancer[J].Endocr Relat Cancer,2007,14:233-244.