分子伴侶及信號(hào)肽對(duì)畢赤酵母中分泌蛋白表達(dá)水平的影響

杜濟(jì)良，趙洪亮，薛沖，任敏，劉志敏

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

酵母是一種具有重要應(yīng)用價(jià)值的低等真核表達(dá)系統(tǒng)，提高酵母表達(dá)外源蛋白水平的工藝方法研究一直備受關(guān)注。傳統(tǒng)的高效表達(dá)思路主要是目的基因的高拷貝、強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄目的基因，乃至分泌信號(hào)肽優(yōu)化篩選等，對(duì)于這些提高表達(dá)的策略已有較深入的研究。但也有不少研究發(fā)現(xiàn)某些外源蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并非與基因拷貝數(shù)呈線性相關(guān)，相反地，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)水平達(dá)到一定程度后即開始下降，這提示還有其他因素制約蛋白表達(dá)水平[1]。之后，人們又發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍赘咚奖磉_(dá)時(shí)，易發(fā)生蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯(cuò)誤折疊和積累，甚至出現(xiàn)沉淀，而錯(cuò)誤折疊的蛋白被禁止轉(zhuǎn)運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或被蛋白酶體降解清除。因此，有人推測(cè)新生肽鏈在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)加工過(guò)程可能是限制外源蛋白表達(dá)水平閾值的又一個(gè)重要原因[2]。

分析以往外源蛋白質(zhì)在酵母中高效表達(dá)的文獻(xiàn)不難發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)研究限定于某一種因素對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)效率的影響，而忽視了蛋白質(zhì)表達(dá)是一個(gè)多細(xì)胞定位的功能系統(tǒng)之間協(xié)調(diào)互動(dòng)的有序整體，其中任何一種因素的影響都有一定限度，過(guò)分強(qiáng)調(diào)某種因素，如基因拷貝數(shù)、啟動(dòng)子效率等，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)影響的評(píng)價(jià)將是有失偏頗的。目前，對(duì)于如何提高外源蛋白在酵母中的表達(dá)水平，我們更應(yīng)該關(guān)注不同因素之間協(xié)調(diào)配合的潛力。

分子伴侶是一大類在生物大分子折疊、組裝及降解過(guò)程中起重要的協(xié)同作用，但自身并不發(fā)生任何變化的蛋白質(zhì)分子[3]。不同細(xì)胞定位的分子伴侶具有不同的功能。細(xì)胞質(zhì)中的分子伴侶的主要功能是協(xié)助蛋白質(zhì)核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，同時(shí)分子伴侶之間相互作用，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白多聚體解聚和降解，維護(hù)細(xì)胞正常的生理代謝狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的分子伴侶蛋白主要是介導(dǎo)蛋白質(zhì)核糖體結(jié)合到到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，并組成蛋白質(zhì)多肽連轉(zhuǎn)運(yùn)通道，例如Sec61、Sec62和Sec63組成的轉(zhuǎn)運(yùn)通道能轉(zhuǎn)運(yùn)多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中[4-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的分子伴侶對(duì)保證蛋白質(zhì)正確折疊具有重要作用。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在鼠淋巴細(xì)胞瘤中輔助免疫球蛋白重鏈折疊的分子伴侶以復(fù)合物的形式存在，包括Bip、GRP94、PDI、ERdj3、Erp72、GRP170。各分子伴侶之間相互作用的同時(shí)，也與待折疊蛋白相互作用。其中Bip和GRP94含量豐富，進(jìn)而形成以Bip為主的分子伴侶系統(tǒng)，另一個(gè)主要的分子伴侶系統(tǒng)是以鈣聯(lián)蛋白（calnexin）和鈣網(wǎng)蛋白（calretieulin）為主的伴侶系統(tǒng)[7]。已有研究表明，將2種或2種以上分子伴侶同時(shí)轉(zhuǎn)入菌體，多種分子伴侶協(xié)同作用，表達(dá)量的提高更明顯[8]。

另外，酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于信號(hào)肽序列有著特殊的選擇性，常用的信號(hào)肽有α交配因子（αMF）、酸性磷酸酯酶（PHO1）、菊粉酶信號(hào)肽序列（INU）、蔗糖酶（SUC2）等內(nèi)源性信號(hào)肽，均可提高外源蛋白的表達(dá)效率；同時(shí)，翻譯共轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽和翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽對(duì)外源蛋白的表達(dá)也有明顯的影響。我們根據(jù)已知的影響外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母中表達(dá)的因素，選取分子伴侶和信號(hào)肽作為研究對(duì)象，以酵母內(nèi)源性胞外-β-1，3-葡聚糖酶（EXG1）為報(bào)告蛋白，探討了分子伴侶及其與分泌信號(hào)肽是否對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)有影響。

1 材料和方法

1 材料

巴斯德畢赤酵母宿主菌GS115是組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母，在BMGY培養(yǎng)基中于30℃搖床上培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，由本室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物科技公司；大腸桿菌-酵母穿梭型質(zhì)粒pPIC9購(gòu)自Invitrogen公司，含有Amp抗性基因及AOX強(qiáng)啟動(dòng)子，可用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；pPBLArg-IX質(zhì)粒由本室保存。

Pushion超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、牛小腸堿性磷酸酶（ACIP）、T4DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；EXG1酶促反應(yīng)底物對(duì)硝苯基-B-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）購(gòu)自Sigma公司；In-Fusion Aavan?tage PCR Cloning試劑盒購(gòu)自Clontech公司；電擊轉(zhuǎn)化儀購(gòu)自BioRad公司；Unico UV-2100紫外分光光度計(jì)購(gòu)自UNICO公司。PCR引物由上海生工公司合成

BMGY培養(yǎng)基（1 L）：10 g酵母浸出物、20 g蛋白胨溶于700 mL水，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫，加入100 mL 1 mol/L磷酸緩沖液（pH6.0）、100 mL 13.4%YNB、2 mL 0.02%生物素、100 mL 20%甘油，混勻備用。

MD培養(yǎng)基平板：20 g瓊脂、160 mL無(wú)菌水，121℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫，加入20 mL 10×YNB、20 mL 20%葡萄糖、40 μL 500×生物素，混勻備用。

1.2 報(bào)告蛋白EXG1不同類型信號(hào)肽基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)PUBMED公布的EXG1序列及αMF、Bip的信號(hào)肽序列設(shè)計(jì)引物（表1），通過(guò)雙酶切方式將攜帶不同信號(hào)肽的EXG1基因片段（圖1）定向插入pPIC9質(zhì)粒（圖2）。

以畢赤巴斯德酵母GS115基因組中EXG1基因序列為模板，分別以引物F1和F8及引物F2和F8擴(kuò)增EXG1（自身信號(hào)肽）和EXG1-αMF的基因片段。以GS115基因組中EXG1基因序列為模板，先以引物F4與F8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再以該P(yáng)CR產(chǎn)物為模板，用引物F3與F8擴(kuò)增EXG1-αPre片段。以GS115基因組中EXG1基因序列為模板，用引物F6與F8以引物F7與F8的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，再以此PCR產(chǎn)物為模板，用引物F5與F8進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到EXG1-Bip片段。

上述PCR反應(yīng)體系為：10×Pyrobest緩沖液5 μL，2.5 μmol/L dNTP 4 μL，2 μL引物Fn（n=1～7），2 μL 引物 F8，1 μL 模板，0.3 μL Pyrobest聚合酶，36 μL H2O。PCR 反應(yīng)條件均為：94℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸（1 min/kb），25個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，片段大小與預(yù)期值一致，回收PCR產(chǎn)物，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切2 h，連接到pPIC9［BamHⅠ（或XhoⅠ）/EcoRⅠ］質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性單克隆，并送英駿公司測(cè)序，測(cè)定的基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致，即該載體構(gòu)建成功。

圖1 幾種不同類型信號(hào)肽結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 EXG1-pPIC9重組質(zhì)粒示意圖

1.3 分子伴侶質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 pBLArg-IX質(zhì)粒啟動(dòng)子的重建 pBLArg-IX質(zhì)粒原有的啟動(dòng)子是甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AOX1，為充分表達(dá)分子伴侶，須用組成型啟動(dòng)子GAP替換AOX1。根據(jù)Invitrogen公司公布的GAP啟動(dòng)子（483 bp）序列，設(shè)計(jì)引物 5'端 F9（NheⅠ，CAGTGCT AGCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC）和 3'端 F10（EcoRⅠ，AAGAATTCCGATCGATGGATCCTTAGTT GTTCAATTGATTGAAATA），在 F10引 物 中 引 入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

按照以下順序加入PCR反應(yīng)組分：10×Pyrobest緩沖液 5 μL，2.5 μmol/L dNTP 4 μL，2 μL 引物F8，2 μL引物 F9，1 μL GAP片段模板，0.3 μL Py?robest聚合酶。PCR反應(yīng)條件：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，片段大小與預(yù)期值基本一致，回收PCR產(chǎn)物，用NheⅠ-HF和EcoRⅠ-HF酶切2 h，試劑盒回收，連接至pBLArg-IX（NheⅠ-HF/EcoRⅠ）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性單克隆，并送英駿公司測(cè)序，測(cè)定的基因序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致，即為構(gòu)建成功。

1.3.2 分子伴侶及其組合質(zhì)粒的構(gòu)建 Sec61α和Sec61β、Ydj1、Ssa1、Hsp104、Bip、EroI、PDI均 以GS115基因組為模板，HacI以釀酒酵母基因組為模板。設(shè)計(jì)相關(guān)引物。

按照以下順序加入PCR反應(yīng)組分：10×Pyrobest緩沖液 5 μL，2.5 μmol/L dNTP 4 μL，2μL 5'端引物F，2 μL 3'端引物F9，1 μL模板，0.3 μL Pyrobest聚合酶。PCR反應(yīng)條件：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸（1 min/kb），25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，片段大小與預(yù)期值基本一致，回收PCR產(chǎn)物，用BamHⅠ-HF和EcoRⅠ-HF酶切2 h，試劑盒回收，連接pBLArg-IX（BamHⅠ-HF/EcoRⅠ）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性單克隆，并送英駿公司測(cè)序，測(cè)定的基因序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致，即為構(gòu)建成功。

表1 EXG1的引物序列及其酶切位點(diǎn)

因Hsp104序列中存在一個(gè)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，所以采用同源融合法構(gòu)建質(zhì)粒。引物中含有與pBLArg-IX序列相同的同源臂5'端引物（AATTGAACAACTAAGAAACGATGGAAGAAACAC AGTTTACAGATAGAGC）和 3'端引物（ACAGATTC CGCTTAATTAGTCGTAAAGTGGTGCTTGGCATC）。Hsp104-pBLArg-IX質(zhì)粒構(gòu)建方法：5×HF緩沖液10 μL，10 μmol/L dNTP 1 μL，2 μL 5'端引物，2 μL 3'端引物，1 μL GS115基因組模板，0.5 μL Pushion超保真DNA聚合酶，34 μL H2O。PCR反應(yīng)條件：98℃變性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，25 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析，片段大小與預(yù)期值基本一致，回收PCR產(chǎn)物。同源融合體系（10 μL）：Hsp104 4 μL，pBLArg-IX（BamHⅠ/EcoRⅠ）1 μL，5×緩沖液 2 μL，In-Fusion En?zyme 0.5 μL，H2O 2 μL。37℃水浴 15 min，52℃水浴15 min，加入40 μL TE混勻，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性單克隆，并送英駿公司測(cè)序，測(cè)定的基因序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致，即為構(gòu)建成功。

分子伴侶組合表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建（以Ydj1和Ssa1為例）：用NheⅠ/SpeⅠ酶切Ydj1-pBLArg-IX，取GAP+Ydj1+3'AOX表達(dá)框片段連接到經(jīng)NheⅠ酶切的Ssa1-pBLArg-IX中，即為Ydj1/Ssa1-pBLArg-IX質(zhì)粒。同理，將Ydj1、Ssa1表達(dá)框插入Hsp104-pBLArg-IX，得到Y(jié)dj1/Hsp104-pBLArg-IX和Ssa1/Hsp104-pBLArg-IX；將 Bip、EroI、PDI表達(dá)框插入HacI-pBLArg-IX，得 到 Bip/HacI-pBLArg-IX、EroI/HacI-pBLArg-IX、PDI/HacI-pBLArg-IX。

1.4 酵母工程菌的篩選和目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)

將EXG1/αMF-pPIC9、EXG1/αpre-pPIC9、EXG1/Bip-pPIC9、EXG1-pPIC9 質(zhì)粒用 SalⅠ線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在MD培養(yǎng)基平板上28℃培養(yǎng)48 h。挑取5支單克隆，在BMGY培養(yǎng)基中于28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，然后每12 h加入0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，至48 h時(shí)，取菌液上清測(cè)定EXG1酶活，篩選陽(yáng)性單克隆。取1 mL菌液，5000 r/min離心30 s，取上清500 μL加到已在37℃孵育5 min的pNPG（10 mmol/L，0.5 mL）-醋酸緩沖液（1 mL，pH5.1）混合液中，再于37℃孵育30 min，然后加入2 mL 0.2 mol/L Na2CO3終止酶促反應(yīng)，當(dāng)溶液顏色變?yōu)榱咙S色即為EXG1表達(dá)的陽(yáng)性菌。

挑取陽(yáng)性單克隆菌落至5 mL YPD培養(yǎng)基，于28℃搖床培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌液D600nm值，然后接種適量菌液到BMGY培養(yǎng)基，終體積為40 mL，D600nm約為1.0，每隔12 h加入0.5%甲醇誘導(dǎo)EXG1表達(dá)，并取菌液上清測(cè)定EXG1酶活性。

1.5 分子伴侶與EXG1的共表達(dá)誘導(dǎo)培養(yǎng)及酶活測(cè)定

將報(bào)告蛋白表達(dá)質(zhì)粒線性化，并電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS200（His/Arg），于MD（+Arg）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并篩選陽(yáng)性單克隆菌落。方法同報(bào)告蛋白在畢赤酵母GS115中的方法。

將分子伴侶質(zhì)粒線性化，電擊轉(zhuǎn)化GS200（His/Arg）報(bào)告蛋白表達(dá)陽(yáng)性菌，于MD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后在BMGY培養(yǎng)基中用甲醇誘導(dǎo)EXG1表達(dá)。方法同報(bào)告蛋白在畢赤酵母GS115中的方法。

將0.5 mL 10 mmol/L pNPG與1.0 mL（pH5.1）醋酸緩沖液混合，37℃溫育5 min；取24、36、48 h時(shí)的菌液各1 mL，5000 r/min離心30 s，取上清500 μL加入pNPG中，37℃溫育30 min，再加入2 mL 0.2 mol/L Na2CO3終止酶促反應(yīng)，測(cè)定酶促反應(yīng)溶液的D400nm值。

2 結(jié)果

2.1 報(bào)告蛋白基因與分子伴侶基因的克隆

自身信號(hào)肽報(bào)告蛋白EXG1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果見圖3，相應(yīng)分子伴侶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果見圖4。

2.2 細(xì)胞質(zhì)分子伴侶對(duì)EXG1表達(dá)水平的影響

細(xì)胞分子伴侶Ydj1、Ssa1、Hsp104及其組合Ydj1/Ssa1、Ydj1/Hsp104、Ssa1/Hsp104對(duì) EXG1-αPre及自身信號(hào)肽EXG1的表達(dá)水平均無(wú)影響。同時(shí)，它們對(duì)EXG1-αMF表達(dá)水平的提高幅度僅為10%～20%，影響不明顯。Ydj1使EXG1-Bip表達(dá)水平提高了10%，其他分子伴侶及其組合對(duì)EXG1-Bip表達(dá)水平均無(wú)顯著性影響，相關(guān)結(jié)果沒有顯示。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜分子伴侶對(duì)EXG1表達(dá)水平的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Sec61α和Sec61β對(duì)各種信號(hào)肽介導(dǎo)的EXG1的表達(dá)水平影響較大，其中對(duì)EXG1-αMF、EXG1-αPre、EXG1-Bip表達(dá)水平的提升幅度均為20%～30%。另外，Sec61α和Sec61β使自身信號(hào)肽EXG1的表達(dá)水平分別提高了38.9%和32.4%，提高幅度略大于它們對(duì)EXG1-αMF、EXG1-αPre及EXG1-Bip表達(dá)水平的影響。而且，在提高 EXG1-αMF、EXG1-αPre及 EXG1-Bip表達(dá)的過(guò)程中，Sec61β的作用略大于Sec61α，見圖5。

圖3 凝膠電泳鑒定EXG1基因的PCR產(chǎn)物

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔分子伴侶對(duì)EXG1表達(dá)水平的影響

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔分子伴侶對(duì)EXG1-αMF、EXG1-αPre、EXG1-Bip和EXG1的表達(dá)水平有重要影響，而且不同分子伴侶的影響不盡相同，見表2。可以看出，EroI/HacI組合使除自身信號(hào)肽EXG1外的其他3種信號(hào)肽介導(dǎo)的EXG1的表達(dá)水平均有不同程度的提高。雖然EroI/HacI組合使EXG1-αPre的表達(dá)提高了3.8倍，高于EXG1-αMF表達(dá)水平提高的2.65倍，但提高后的表達(dá)水平之間基本相當(dāng)，即達(dá)到EXG1的最高表達(dá)水平。Bip-HacI、EroI/HacI和PDI/HacI等3種組合使EXG1-Bip的表達(dá)水平均有小幅提高，其中EroI/HacI的影響略大于其他2種組合。結(jié)果參見圖6。

圖4 凝膠電泳鑒定分子伴侶及HacI基因片段的PCR產(chǎn)物

3 討論

3.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化的方向

圖5 Sec61α和Sec61β對(duì)EXG1-αMF、EXG1-αPre、EXG1-Bip和EXG1表達(dá)水平的影響

圖6 分子伴侶Bip、EroI、PDI與HacI組合對(duì)各信號(hào)肽的EXG1表達(dá)水平的影響

表2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔分子伴侶Bip、EroI、PDI與HacI的組合對(duì)各種信號(hào)肽EXG1表達(dá)水平的影響

外源蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞的分泌表達(dá)過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的加工是非常重要的環(huán)節(jié)，當(dāng)外源蛋白質(zhì)的合成水平超過(guò)了正常狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工能力，輔助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶就相對(duì)不足，使得蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中產(chǎn)生大量未折疊蛋白及錯(cuò)誤折疊，進(jìn)而形成蛋白質(zhì)多聚體，從而對(duì)酵母細(xì)胞正常生理功能及代謝產(chǎn)生壓力。此時(shí)，該壓力將應(yīng)急激活細(xì)胞內(nèi)的折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），然后，細(xì)胞即大量合成蛋白質(zhì)折疊相關(guān)分子伴侶，以幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的蛋白質(zhì)進(jìn)行去錯(cuò)誤折疊、解聚，最終產(chǎn)生具有正確構(gòu)象的蛋白質(zhì)[9]。值得注意的是，雖然錯(cuò)誤折疊的蛋白誘導(dǎo)UPR發(fā)生，但卻不是最直接的誘導(dǎo)因素，根本的原因是錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合大量游離狀態(tài)的分子伴侶，致使游離態(tài)分子伴侶的濃度急劇下降，才激發(fā)了UPR的發(fā)生[10]。HacI是UPR過(guò)程中重要的信號(hào)傳遞分子[11]，然而嚴(yán)格地講，HacI并不是真正意義上的分子伴侶。但是，HacI的mRNA在UPR情況下重新編輯，能促進(jìn)UPR相關(guān)蛋白質(zhì)及分子伴侶的高水平表達(dá)，以幫助錯(cuò)誤折疊蛋白的解聚、去錯(cuò)誤折疊及再折疊，最終間接地提高了蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。鑒于此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將HacI與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的分子伴侶組合后進(jìn)行研究。將HacI和分子伴侶EroI共表達(dá)時(shí)，高水平的HacI提高了折疊蛋白質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)水平，同時(shí)EroI又激活了這些相關(guān)基因中的分子伴侶PDI的活性，而PDI能夠防止新生多肽多聚體產(chǎn)生，而且能使錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)解聚，重新正確折疊裝配。在本實(shí)驗(yàn)中，我們推測(cè)由于EXG1-Bip的表達(dá)水平相對(duì)較低，不會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中產(chǎn)生嚴(yán)重的錯(cuò)誤折疊甚至聚集現(xiàn)象，進(jìn)而不能完全激活UPR，所以EroI-HacI組合對(duì)EXG1-Bip的作用相對(duì)不太明顯。而EXG1-αMF和EXG1-αPre的高表達(dá)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中產(chǎn)生大量多聚體，激活了UPR，最大程度地發(fā)揮了EroI和PDI的作用，進(jìn)而大幅度提高了EXG1的表達(dá)水平。

在以往的研究中，更多關(guān)注的是某一種分子伴侶在蛋白質(zhì)高水平表達(dá)過(guò)程中的作用，而本研究結(jié)果提示，分子伴侶是一個(gè)相互影響、相互作用的有機(jī)整體，如EroI與PDI之間存在的相互作用，應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的結(jié)構(gòu)特征，選擇合適的分子伴侶優(yōu)化表達(dá)組合。如報(bào)告蛋白EXG1，相對(duì)于具有二硫鍵功能的Bip而言，當(dāng)EXG1高水平表達(dá)的負(fù)面影響因素是多聚體時(shí)，那么PDI對(duì)EXG1的作用更為重要和明顯。因此，針對(duì)分子伴侶對(duì)酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)該根據(jù)目的蛋白的分子特征而區(qū)別對(duì)待，構(gòu)建相對(duì)應(yīng)的表達(dá)工程菌，而不是寄希望于構(gòu)建出一種“萬(wàn)能”的表達(dá)系統(tǒng)。

3.2 分子伴侶與信號(hào)肽對(duì)外源蛋白表達(dá)水平的影響

外源蛋白質(zhì)在酵母細(xì)胞中的合成分泌過(guò)程涉及到新生多肽-核糖體復(fù)合體在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)，以及新生肽穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中折疊加工修飾，再轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，增加細(xì)胞質(zhì)分子伴侶的表達(dá)水平未能明顯提高4種信號(hào)肽介導(dǎo)的EXG1表達(dá)水平，同時(shí)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)通道Sec61的數(shù)量也未能提高EXG1的表達(dá)水平，這提示多肽-核糖體復(fù)合體從胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，這些分子伴侶與信號(hào)肽之間沒有明顯的相互作用。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中分子伴侶Bip、EroI、PDI與HacI提高了不同信號(hào)肽的EXG1表達(dá)水平，但這種效應(yīng)不是由于分子伴侶作用于αMF、αPre和Bip信號(hào)肽，而是分子伴侶作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中新生多肽的加工折疊的結(jié)果。鑒于此，我們認(rèn)為在EXG1新生肽的合成分泌過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的分子伴侶對(duì)于該新生肽的作用不受信號(hào)肽部分的影響。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔是蛋白質(zhì)生物合成加工的重要細(xì)胞器，大量研究已證實(shí)其中的分子伴侶的作用是防止蛋白質(zhì)在折疊過(guò)程中由于疏水區(qū)域的暴露而形成非共價(jià)的聚合體，以及通過(guò)分子間二硫鍵形成共價(jià)聚合體，并且能夠解聚錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)多聚體。例如，PDI加快了正確二硫鍵的形成速率，從而可提高蛋白質(zhì)的正確折疊率和比活性[12]；而Bip能夠結(jié)合到轉(zhuǎn)運(yùn)到ER內(nèi)的新生多肽并幫助其正確折疊，同時(shí)還能將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出ER[10]。但是，目前有關(guān)分子伴侶之間的相互作用及它們可能形成的功能系統(tǒng)的作用機(jī)制尚不明了。因此，考慮到酵母表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)，分子伴侶的系統(tǒng)性研究將極具潛在的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。

綜上，EXG1在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)，主要受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔分子伴侶的影響，是EXG1合成過(guò)程的限速步驟之一。通過(guò)提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蛋白質(zhì)折疊相關(guān)分子伴侶的表達(dá)水平，能夠明顯提高EXG1的表達(dá)水平。特別是通過(guò)將蛋白質(zhì)多聚體及錯(cuò)誤折疊識(shí)別信號(hào)分子HacI和分子伴侶EroI共表達(dá)，能夠顯著提高報(bào)告蛋白EXG1的表達(dá)量。

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