DADLE對急性全腦缺血再灌注大鼠心肺腎損傷保護作用的研究

劉佩儀 黃偉青 洪妙玲 武釗 文銳玲 郭蘭英 郭偉 黃瑞嬌

·論著·

DADLE對急性全腦缺血再灌注大鼠心肺腎損傷保護作用的研究

劉佩儀 黃偉青 洪妙玲 武釗 文銳玲 郭蘭英 郭偉 黃瑞嬌

目的通過二血管阻斷加低血壓法建立大鼠急性全腦缺血再灌注模型，探討在腦缺血再灌注情況下DADLE對于心肺腎的保護作用。方法將50只SD大鼠隨機分為5組：假手術組(Sham)、模型組(I/R)、DADLE處理組(根據不同劑量可分為2 mg/kg[A]、3 mg/kg[B]、5 mg/kg[C])。采用改良的二血管阻斷加低血壓法建立全腦缺血再灌注模型。手術后立即取心肺腎，常規HE染色觀察其形態學改變。結果I/R組心肌細胞間有出血現象，心肌細胞有輕度萎縮,少量炎性細胞浸潤；肺臟表現為肺泡間隔增寬，毛細血管擴張充血，肺胞腔內及血管周圍中性粒細胞浸潤，氣管壁部分上皮脫落，肺胞腔及氣管腔均有漿液滲出，肺大泡形成越來越多；腎臟表現為腎小球與腎間質有少量充血, 腎小球毛細血管未見明顯擴張。DADLE處理組心肌出血減少并逐漸被吸收(P<0.05)；肺臟充血減輕，中性粒細胞浸潤有所減少(P<0.05)；腎臟可見腎小球無明顯充血腫脹，間質亦無明顯瘀血。DADLE處理組組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論改良的二血管阻斷加低血壓法建立大鼠全腦缺血再灌注模型對心肺均有不同程度的損傷，但對腎臟影響較小，并且DADLE對全腦缺血再灌注大鼠心肺損傷有一定的保護作用，但與劑量無明顯相關。

DADLE；全腦缺血再灌注；心肺腎損傷

目前有很多研究證實δ阿片受體激動劑DADLE對大鼠全腦缺血再灌損傷有保護作用[1], DADLE 成為近年來研究神經保護的領域中的熱點。近年發現DADLE在急性缺血再灌注實驗中, 可以提高組織氧利用率、維持組織氧代謝平衡從而減輕組織缺氧造成的能量代謝紊亂, 減少細胞和組織的損傷[4]。本研究通過建立大鼠全腦缺血再灌注模型，給予DADLE干預，從而探討其在腦缺血損傷中對于心肺腎等重要臟器的保護作用，評估其應用價值。

1 資料與方法

1.1實驗材料 DADLE(D-Ala2-D-Leu5-enkephali)分子式C29H39N507 購自美國Sigma公司，BL-420E生物機能實驗系統由四川泰盟科技有限公司生產，24 g×19 mmY型留置針由威海潔瑞醫用制品有限公司提供。

1.2動物及分組 SD大鼠50只，雌性，體重180～220 g，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供，合格證號SCXK(粵)2008-0020。于廣州醫學院實驗動物中心喂養，實驗前適應喂養1周。大鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型組(I/R)、DADLE處理組，其中DADLE處理組又分為2 mg/kg(A)、3 mg/kg(B)、5 mg/kg(C)三個亞組，每組各10只。

1.3二血管阻斷加低血壓建立大鼠全腦缺血再灌注模型 模型組(I/R)大鼠 2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取仰臥位固定。切開左側大腿股部處皮膚，準確分離股動脈后采用靜脈留置針行動脈插管，后以縫線固定，通過Y型留置針注射肝素60IU/kg達到全身肝素化。右側股動脈以相同的方法行動脈插管，并與BL-420E生物機能實驗系統連接，通過生物機能實驗系統監測記錄動脈血壓。頸正中切口,分離雙側頸總動脈和左側頸靜脈，經左側頸靜脈插管建立體外給藥途徑。通過左側股動脈插管回抽血液至平均動脈壓達30～40 mm Hg，然后用微型動脈夾夾閉雙側頸總動脈，進入缺血期。缺血15 min后移去微型動脈夾去除雙側頸總動脈的夾閉，于左側股動脈回輸血液至血壓達到正常(回輸速度勻速且緩慢)，此為再灌注期，本實驗再灌注期時間為120 min。DADLE處理組于再灌注前經由左側頸靜注射不同劑量的DADLE(A組2 mg/kg、B組3 mg/kg、C組 5 mg/kg)。Sham組除了不進行頸動脈夾閉、不抽血、不給藥外，其余操作同前。

1.4HE標本的制備及染色觀察 灌注120 min后，處死大鼠，斷頭放血，取心肺腎，經生理鹽水漂洗后于4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，行常規HE染色后觀察其形態學改變。

1.5統計學分析 統計方法用t檢驗，數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 大鼠不同處理后心肺腎形態變化(HE，×400)

2.1全腦缺血再灌注大鼠心肌病理改變 見表1，從表1可見，I/R組病理表現均有較Sham組發生率增高的趨勢，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。而DADLE處理組(包括A、B、C組)較I/R組病理表現有明顯下降的趨勢(除外炎性浸潤)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。而A、B、C組心肌病理異常發生率差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2全腦缺血再灌注大鼠肺臟病理改變 見表2，從表2可見，I/R組病理表現均有較Sham組發生率增高的趨勢，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。而DADLE處理組(包括A、B、C組)較I/R組病理表現有明顯下降的趨勢(除外血管充血)，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。而A、B、C組肺臟病理異常發生率差異無統計學意義(P>0.05)。

注：與Sham組相比，*P<0.05；與I/R組相比，#P<0.05

病理表現Sham組I/R組A組B組C組合計例數101010101050正常81*3#4#3#19炎性浸潤16*32416細胞間出血18*3#3#2#17間隔增寬29*2#3#4#21

表2 全腦缺血再灌注大鼠肺病理改變

注：與Sham組相比，*P<0.05；與I/R組相比，#P<0.05

2.3全腦缺血再灌注大鼠腎臟病理改變 I/R組腎臟表現為腎小球與腎間質有少量充血, 腎小球毛細血管未見明顯擴張。DADLE處理組腎臟可見腎小球無明顯充血腫脹，間質亦無明顯瘀血。A、B、C組腎臟無明顯病理異常。

3 討論

心臟驟停復蘇后引起急性腦組織不同程度的損傷, 而且可能還誘發其他重要臟器的損傷。本實驗采用改良的二血管阻斷加低血壓法建立全腦缺血再灌注模型，給予不同劑量的DADLE干預，取心肺腎各臟器組織切片，經HE染色在光鏡下觀察到:

I/R組心肌細胞間有出血現象，心肌細胞有輕度萎縮,少量炎性細胞浸潤；肺臟表現為肺泡間隔增寬，毛細血管擴張充血，肺胞腔內及血管周圍中性粒細胞浸潤，氣管壁部分上皮脫落，肺胞腔及氣管腔均有漿液滲出，肺大泡形成越來越多；腎臟表現為腎小球與腎間質有少量充血, 腎小球毛細血管未見明顯擴張。DADLE處理組心肌出血減少并逐漸被吸收(P<0.05)；肺臟充血減輕，中性粒細胞浸潤有所減少(P<0.05)；腎臟可見腎小球無明顯充血腫脹，間質亦無明顯瘀血。DADLE處理組組間差異無統計學意義(P>0.05)。

以上結果表明改良的二血管阻斷加低血壓法建立大鼠急性全腦缺血再灌注模型可對心肺均有不同程度的損傷，但對腎臟影響較小，并且DADLE對急性全腦缺血再灌注大鼠心肺損傷有一定的保護作用，與劑量無明顯相關。因此，我們認為首次研究DADLE對全腦缺血再灌注大鼠心肺損傷有一定的保護作用是成功的。這將為今后的相關研究打下堅實的基礎。

范紅斌研究表明腦缺血再灌注大鼠腎臟形態學檢查的結果最嚴重的是24 h,但其采用線栓法[7]。而本研究采用改良的二血管阻斷加低血壓法，以血液流變學觀點來分析，此法更符合血液流變學的要求。采用較為柔和的人為作用，在造成急性腦缺血的同時，可能參與維持了某些器官全部或部分雙重血管的開放，基本保證了血液在全身器官的方向性，因此腎臟損傷較小，這給臨床腎移植提供參考價值。但是，關于DADLE對腎臟是否有保護作用仍需進一步研究。

阿片受體分為MOR(M opiate receptors，MOR)、δ型阿片受體(δopiate receptors，DOR)、K型阿片受體(K opiate recetors，KOR)3種亞型[5]。有研究人員發現DOR系統可能參與缺血缺氧神經元的保護和神經發生，近來有實驗表明δ受體激動劑能顯著改善缺血心肌的舒張功能，對缺血心肌有保護作用，同時可能通過多種機制抗神經元缺氧損傷作用[6]。Su發現,與冬眠誘導促發因子(hibernation induction trigger,HIT)一樣,δ阿片受體激動劑DADLE同樣可以誘導冬眠,并可延長肺、腎臟的存活期。國內有關DADLE的研究主要是針對缺血缺氧神經元的保護，而對其他遠隔臟器的保護作用尚無相關的基礎研究。本研究探討在腦缺血再灌注情況下DADLE對于心肺腎的保護作用是國內首次。這給人們尋找治療臨床各種致腦缺血缺氧損傷疾病用藥提供了新的思路。

[1] Liu WY, Jin ZX. Opioid receptor induced myocardial hibernating and myocardial protection. Chin J Ext Circ,2004,2(1):53-55.

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[6] 彭翔,梁子敬,韓潔韻,等.δ阿片受體激動劑DADLE對犬心肺復蘇后血流動力學的影響.中國現代醫學雜志,2008,18(15):20.

[7] 范紅斌,等.腦缺血再灌注時心腎損傷的形態學變化及代謝特征.中國老年學雜志,2009，8(27)，2039-2041.

ProtectiveeffectofDADLEonacutecerebralischemiareperfusioninratheartlungkidneyinjury

LIUPei-yi，HUANGWei-qing，HONGMiao-ling，WUZhao,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollegeGuangzhou510120,China

ObjectiveThrough two vessels occlusion add hypotension to establish the global cerebral ischemia/reperfusion(I/R)model，To dicuss the protective effects with DADLE on heart,lung and renal injury after the global cerebral ischemia/reperfusion.MethodsIn total, 50 SD rats were randomly divided into 5 groups:a sham-operated, a I/R and three DADLE-treated(different drug doses:2 mg/kg[A], 3 mg/kg[B] and 5 mg/kg[C]).Use improvement of two vessels occlusion add hypotension to establish the global cerebral ischemia/reperfusion model in rats.The morphology changes of heart,lung and renal were evaluated by hematoxylin-eosin staining method.ResultsOn I/R group,the heart performance for bleeding phenomenon and atrophy in myocardial cells and infiltrating by inflammatory cells;the lung performance for broadening on the alveolar interval,infiltrating by inflammatory cells;forming more and more lung bubbles;the renal performance for a few congestion on the glomerular and interstitial.DADLE-treated group bleeding less and absorbed gradually into the myocardial cells(P<0.05);less bleeding and infiltrating by inflammatory cells among the lung;the renal had not change aprecrably obviously.There were no obvious difference on DADLE-treated groups(P>0.05).ConclusionThere are different degrees of injury on the heart and lung but renal by the improvement of two vessels occlusion add hypotension to establish the global cerebral ischemia/reperfusion model in rats.And DADLE may be have some protective effects on heart and lung injury after the global cerebral ischemia/reperfusion in rats,but it isn’t related to dose obviously.

DADLE; Global cerebral ischemia/reperfusion; Heart, lung and renal injury; HE staining

2011年廣州市大學生科技創新實踐項目(項目編號：1057011004)；廣州市醫藥衛生科技項目(項目編號：201102A213152)

510120 廣州醫學院第一附屬醫院

黃偉青