脊髓神經(jīng)元鉀通道在鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用

劉潤宇，張 野

鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[1]，明確其機(jī)制具有重要意義。Wong et al[2]報(bào)道鞘內(nèi)注射嗎啡進(jìn)行遠(yuǎn)端預(yù)處理，主要是通過激活脊髓阿片受體對(duì)遠(yuǎn)隔心臟發(fā)揮保護(hù)作用，而脊髓神經(jīng)元上的多種鉀通道均能被阿片受體激活，作為其下游效應(yīng)器發(fā)揮作用[3-4]。該研究擬評(píng)價(jià)脊髓神經(jīng)元鉀通道在心肌缺血再灌注損傷及鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑ALC-V9型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；BL-420S型連接生物機(jī)能系統(tǒng)(成都泰盟生物科技有限公司)；PE-10導(dǎo)管(英國Smiths Medical 公司)；鹽酸嗎啡注射液(1 ml ∶10 mg，批號(hào)130904-1，東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司)；格列苯脲(GLI,貨號(hào)G0639-5G-9)、尼可地爾(NICO,貨號(hào)N3539-50MG)(美國Sigma公司)。

1.2SD大鼠鞘內(nèi)置管模型制備選取健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～350 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，參照文獻(xiàn)[5],在大鼠頸背部沿脊柱切開皮膚約2 cm，逐層分離肌肉組織，使寰枕膜暴露，用12號(hào)針頭輕輕挑破寰枕膜，自挑破處將PE-10導(dǎo)管向尾端置入蛛網(wǎng)膜下腔約4 cm，固定導(dǎo)管，縫合傷口。術(shù)后肌肉注射青霉素10萬U,予以單籠飼養(yǎng)3 d，以備下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3SD大鼠心肌缺血再灌注損傷模型建立使用鞘內(nèi)置管成功后飼養(yǎng)3 d，無感染和感覺運(yùn)動(dòng)功能異常的SD大鼠，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉，劑量為60 mg/kg。麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，切開氣管，插入氣管導(dǎo)管并固定，使用ALC-V9型動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣控制呼吸，潮氣量按照20 ml/kg計(jì)算，呼吸頻率70次/min。連接BL-420S型連接生物機(jī)能系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)記錄心電圖。沿胸骨左側(cè)4～5肋間開胸，置入胸?fù)危g性分離心包膜，準(zhǔn)確找到左心耳，使用棉簽輕輕撥開左心耳，用針將6-0聚丙烯線自肺動(dòng)脈圓錐和左心耳下方以冠狀靜脈主為中心穿過，進(jìn)針深度約為3 mm，寬度3～5 mm。將線穿過可控制開放的冠狀動(dòng)脈左前降支阻斷器(利用兩個(gè)移液器槍頭自制)中。封閉阻斷器，使線結(jié)收緊，造成左前降支支配的心肌缺血，該區(qū)域的心肌顏色隨阻斷時(shí)間增加逐漸發(fā)白，心電圖呈明顯的心肌缺血改變(ST段抬高或降低等)，甚至出現(xiàn)頻繁的室性早搏。心律失常表現(xiàn)在缺血后的5 min左右最為顯著。缺血30 min后，通過松開線結(jié)進(jìn)行再灌注，心律失常在恢復(fù)灌注后立即出現(xiàn)，尤以室性心律失常常見，后心律逐漸平穩(wěn)，ST段逐漸下降，缺血區(qū)域心肌發(fā)紺現(xiàn)象逐漸緩解。再灌注時(shí)間為120 min。

1.4實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)主要研究脊髓神經(jīng)元鉀通道在鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中的作用和機(jī)制。為此本實(shí)驗(yàn)使用鞘內(nèi)成功置管的大鼠共70只，隨機(jī)分成7組，每組10只。分別為Sham組、IRI組、IRI+鉀通道開放劑(尼可地爾，NICO)組、ITMP組、ITMP+鉀通道阻滯劑(格列本脲，GLI)組以及兩組對(duì)照組：Sham+鉀通道開放劑(NICO)組和IRI+鉀通道阻滯劑(GLI)組。① Sham組：腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)，氣管切開插管，開胸后于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間穿線但不結(jié)扎，連接生物機(jī)能系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)心電圖。190 min后處死，留取心臟和脊髓組織。② IRI組：6-0聚丙烯線在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間的冠狀動(dòng)脈左前降支下方穿線。穩(wěn)定40 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結(jié)，恢復(fù)灌注120 min。結(jié)扎前30 min，模擬嗎啡預(yù)處理向鞘內(nèi)注射10 μl生理鹽水，注射時(shí)間5 min，重復(fù)3次，每次間隔5 min。③ ITMP組：6-0聚丙烯線在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間的冠狀動(dòng)脈左前降支下方穿線。穩(wěn)定40 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結(jié)，恢復(fù)灌注120 min。結(jié)扎前30 min，鞘內(nèi)輸注嗎啡(3 μg/kg)10 μl，持續(xù)5 min，再停止5 min，循環(huán)3次。④ IRI+NICO組：6-0聚丙烯線在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間的冠狀動(dòng)脈左前降支下方穿線。穩(wěn)定40 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結(jié)，恢復(fù)灌注120 min。結(jié)扎前40 min，鞘內(nèi)注射鉀通道開放劑NICO 10 μl(100 μg,劑量參照文獻(xiàn)[6])；結(jié)扎前30 min，模擬嗎啡預(yù)處理向鞘內(nèi)注射10 μl生理鹽水，注射時(shí)間5 min，重復(fù)3次，每次間隔5 min。⑤ ITMP+GLI組：6-0聚丙烯線在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間的冠狀動(dòng)脈左前降支下方穿線。穩(wěn)定40 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結(jié)，恢復(fù)灌注120 min。結(jié)扎前40 min，鞘內(nèi)注射鉀通道阻滯劑GLI 10 μl(50 μg)；結(jié)扎前30 min，鞘內(nèi)輸注嗎啡(3 μg/kg) 10 μl，持續(xù)5 min，再停止5 min，循環(huán)3次。⑥ Sham+NICO組：開胸后于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間冠狀動(dòng)脈下方穿線但不結(jié)扎，連接生物機(jī)能系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)心電圖，鞘內(nèi)注射鉀通道開放劑NICO 10 μl(100 μg)，注射后監(jiān)測(cè)190 min處死留取心肌組織和脊髓。⑦ IRI+GLI組：6-0聚丙烯線在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳間的冠狀動(dòng)脈左前降支下方穿線。穩(wěn)定40 min后，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，心肌缺血30 min；松開線結(jié)，恢復(fù)灌注120 min。結(jié)扎前40 min，鞘內(nèi)注射鉀通道阻滯劑GLI 10 μl(50 μg)；結(jié)扎前30 min，模擬嗎啡預(yù)處理向鞘內(nèi)注射10 μl 生理鹽水，注射時(shí)間5 min，重復(fù)3次，每次間隔5 min。

1.5標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測(cè)觀察心電圖，記錄再灌注30 min 內(nèi)室性心律失常[室性早搏(premature ventricular contractions，PVCs)及室速∕室顫(ventricular tachycardia/ventricular fibrillation，VT/VF)]發(fā)生次數(shù)。再灌注120 min后，處死大鼠，取出心臟并置于離體心臟灌流架，通過灌流針向主動(dòng)脈內(nèi)注入K-H液(37 ℃)沖洗5 min，沖洗出心肌內(nèi)殘留血液。重新結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，并從主動(dòng)脈注入0.25%伊文思藍(lán)溶液，置于-80 ℃冰箱速凍1～2 h。將冰凍的心臟由心尖到冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線處平切2 mm厚的心肌切片，5～6片。切片置于1%TTC溶液中，37 ℃(pH 7.4)孵育15 min，取出置于10%福爾馬林室溫固定12 h。染色后缺血危險(xiǎn)區(qū)呈紅色，梗死區(qū)為白色，采用Image J 1.38e圖像分析軟件測(cè)定缺血危險(xiǎn)區(qū)體積(area at risk,AAR)、梗死區(qū)體積(infarct size,IS)，并計(jì)算IS/AAR比值，以反映心肌梗死面積。

2 結(jié)果

2.1室性心律失常次數(shù)與Sham組比較，IRI組PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)增加；與IRI組比較，IRI+NICO組、ITMP組 PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)均減少；與ITMP組比較，ITMP+GLI組PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)增加(P<0.05)。見表1。

2.2TTC染色結(jié)果與Sham組比較，IRI組IS/AAR比值升高；與IRI組比較，IRI+NICO組、ITMP組IS/AAR比值均降低；與ITMP組比較，ITMP+GLI組IS/AAR比值升高(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠心肌TTC檢測(cè)結(jié)果

表1 7組大鼠PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)的比較

與Sham組比較：*P<0.05；與IRI組比較：#P<0.05；與ITMP組比較：△P<0.05

表2 7組大鼠心肌病理學(xué)指標(biāo)比較

與Sham組比較：*P<0.05；與IRI組比較：#P<0.05；與ITMP組比較：△P<0.05

3 討論

本研究采用了左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎缺血30 min，再恢復(fù)灌注的方法制備心肌缺血再灌注模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：相比于Sham組，IRI組的PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)增加，IS/AAR比值升高,提示心肌缺血再灌注模型制備成功。相比于IRI組，ITMP組的PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)減少，IS/AAR比值降低，提示鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理具有減輕心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

脊髓是外周各種感覺以及傷害信息傳遞到中樞的樞紐，位于其上的背根神經(jīng)節(jié)中樞突在此與上級(jí)神經(jīng)元換元，從而將外周信息轉(zhuǎn)到至中樞并使中樞釋放神經(jīng)遞質(zhì)[7]。Welch et al[8]率先提出，鞘內(nèi)注射鉀通道開放劑能增加機(jī)體對(duì)外周傷害性刺激的耐受性，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。此后的研究[9-12]也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。而脊髓鉀通道開放對(duì)心肌缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用，先前并沒有研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中,IRI+NICO組較IRI組的PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)明顯減少，IS/AAR比值顯著降低(P<0.05)。提示脊髓神經(jīng)元鉀通道開放能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。這可能與脊髓神經(jīng)元上鉀通道開放，大量鉀離子外流，細(xì)胞超級(jí)化使得神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子減少，神經(jīng)元細(xì)胞興奮性降低，抑制了傷害性刺激的傳遞有關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，為了研究脊髓神經(jīng)元鉀通道是否參與鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理減輕心肌缺血再灌注損傷這一機(jī)制，進(jìn)行了ITMP+鉀通道阻滯劑組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)顯示，與ITMP組比較，ITMP+GLI組PVCs和VT/VF發(fā)生次數(shù)增加,IS/AAR比值升高(P<0.05),提示鞘內(nèi)神經(jīng)元鉀通道的關(guān)閉可減弱ITMP的心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用。已經(jīng)有研究[8]證明脊髓上的阿片受體能激活脊髓神經(jīng)元鉀通道，并通過鉀通道的開放提高對(duì)傷害性刺激的耐受性，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。胡軍 等[13]研究發(fā)現(xiàn)NO-cGMP-PKG通路參與了ITMP減輕大鼠心肌IRI的過程。而其下游蛋白PKG可以激活脊髓神經(jīng)元鉀通道[14]。由此可以推測(cè)ITMP通過NO-cGMP-PKG通路激活脊髓神經(jīng)元鉀通道，使鉀離子外流，細(xì)胞超極化增加了神經(jīng)元對(duì)傷害性刺激的耐受性。從而減輕大鼠心肌IRI，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，脊髓神經(jīng)元鉀通道開放能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，脊髓神經(jīng)元鉀通道參與了鞘內(nèi)嗎啡預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用的過程。