銀杏多糖對四氯化碳誘導急性小鼠肝損傷的保護作用

張福華，尹 麗

(漯河醫學高等專科學校，河南漯河 462002)

銀杏作為我國特有的物種，含有很多活性物質。銀杏葉、銀杏外種皮、白果、銀杏花粉等都有提取銀杏活性物質的報道。研究發現，銀杏中的有效成分可以有效抗氧化、清除自由基、抑菌、增強小鼠免疫功能、保護四氯化碳引起的肝損傷等作用［1～3］。目前關于銀杏多糖的提取研究很多，并已經得到晶體［4］。研究發現，銀杏多糖有一定的抗氧化能力［5～7］，但關于銀杏多糖的體內實驗甚少。本實驗主要研究銀杏多糖對四氯化碳誘導的小鼠肝損傷的保護作用，揭示其機制并為進一步的研究提供參考。

1 材料

1.1 材料與試劑

銀杏葉(11月份，采自漯河醫學高等專科學校校園內)經漯河醫學高等專科學校任亮副教授鑒定為銀杏樹(Ginkgo Biloba)的葉。谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉氨酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物研究所。NO TNF-α試劑盒購自武漢博士德有限公司，聯苯雙酯購自北京協和藥廠，CCl購自上海申鶴化學品有限公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2 動物

昆明小鼠共60只(雌雄各半)，體質量20±2 g，由河南省實驗動物中心提供(許可證號 SCXK(豫)2005-008)。

1.3 儀器設備

RE-52A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，722s分光光度儀(上海第三分析儀器廠)，HH-8數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，ZS83-1型內切式組織勻漿機(浙西機械廠)，CKX41熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)，DU640紫外可見分光光度計(Backman，美國)。

2 方法

2.1 銀杏多糖的提取［8，9］

取銀杏葉1000g蒸餾水洗凈80℃烘干12h，取出粉碎過80目篩。取烘干品100g加入15倍體積蒸餾水，75℃下水浴浸提5h，浸提2次，合并2次濾液，旋轉蒸發儀60℃直到體積為原體積的1/3。然后濃縮液3000rpm離心20min，加入3000ml 95%乙醇，靜置24 h收集沉淀。用蒸餾水反復洗滌，然后用Sevag方法去除沉淀中蛋白質，在核酸最大吸收波長260nm、蛋白質最大吸收波長280nm進行檢測，無明顯吸收峰。再用無水乙醇脫水，之后用乙醚洗滌脫脂，最終得到灰白色銀杏多糖粗制品。經稱量4.15g，得率為4.15%，用時稀釋。

2.3 動物分組與藥物處理

60只昆明小鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、聯苯雙酯組、銀杏多糖高、中、低劑量組，每組10只。其中，銀杏多糖低、中、高劑量組分別以銀杏多糖 200、100、50 mg·kg－1，1 次·d－1進行灌胃;對照組(聯苯雙酯組)聯苯雙酯100 mg·kg－1進行灌胃;空白組和模型組分別以生理鹽水灌胃，連續2周。第14周隔夜禁食12 h后，模型組、銀杏多糖高中低劑量組和對照組小鼠分別腹腔注射0.15%CCl4花生油溶液2ml/只，空白組腹腔注射等劑量花生油，24 h后摘眼球取血，取血前12h小鼠禁食不禁水。然后處死小鼠取肝臟稱其重量，0℃左右生理鹽水沖洗干凈殘留血液，制備肝組織勻漿待用。

2.4 組織學觀察

觀察肝臟的形態和顏色，甲醛溶液固定、常規HE染色，在光鏡下觀察肝組織切片的結構等組織學形態變化。

2.5 生化指標檢測

血清 ALT、AST 及肝臟 SOD、MDA、GSH-Px、NO、TNF-α測定方法均按試劑盒說明書進行。

2.6 統計學方法

應用SPSS16.0軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差(珋x±s)表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 肝組織學觀察

對照組小鼠肝臟顏色光澤鮮亮有彈性且呈紅褐色，光鏡下觀察可見肝小葉結構輪廓清晰，細胞核大而圓，胞漿致密。模型組小鼠肝臟色澤黯淡，表面粗糙。肝小葉結構模糊且紊亂，細胞體積增大，肝細胞成片壞死。銀杏多糖高、中、低劑量組和對照組形態要好于模型組，但仍然有壞死區域，且不連成片，多呈點狀，這表明銀杏多糖對肝損傷有一定保護作用。

3.2 銀杏多糖對CCl4小鼠生化指標的影響

模型組小鼠中血清ALT、AST活性、MDA含量明顯大于對照組，提示造模成功。

表1、2顯示，與空白對組比較，模型組和銀杏多糖低中高劑量組小鼠血清中ALT、AST、MOD含量明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀杏多糖低、中、高劑量組能明顯降低小鼠血清中ALT、AST活性，并與濃度有很大的依賴性。正常情況下，AST、ALT是細胞內酶，血清中含量很少，但當該細胞損傷時，細胞膜通透性增加，酶從細胞內釋放到細胞外，從而導致血清中酶的濃度增加，活性增加，MDA含量升高。實驗結果提示，銀杏多糖對CCl4導致的小鼠肝細胞損傷有一定的保護作用，模型組小鼠肝組織中SOD及GSH-Px活性水平顯著低于正常組(P＜0.01)。與模型組比較，銀杏多糖低中高劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著增加(P＜0.01)。結果顯示，銀杏多糖能顯著抑制肝損傷小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性的降低，提示銀杏多糖有很強的抗氧化能力。

表1 銀杏多糖對肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(珔x±s，n=10)

3.3 銀杏多糖對肝損傷小鼠肝組織NO、TNF-α含量的影響

表3顯示，銀杏多糖可顯著降低肝損傷小鼠血清中NO、TNF-α的含量，與濃度有一定的依賴關系，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表3 銀杏多糖對肝損傷小鼠肝組織中NO、TNF-α含量的影響(珔x±s，n=10)

4 討論

肝臟的一大特征就是含有豐富的酶類，代謝特別活躍，而這些代謝活動的主角是血竇中的血管內皮細胞和星狀細胞。當肝功能持續障礙一定時間后，星狀細胞的性質就會發生改變并制造很多骨膠原，導致肝臟纖維化，同時星狀細胞還會制造平滑肌激動蛋白，收縮血竇。

四氯化碳可直接損害肝細胞引起一些特異變化。四氯化碳在肝臟可代謝生成CCl3自由基和Cl自由基，這2種自由基會破壞細胞膜上的脂質和蛋白質大分子，引起代謝障礙，導致脂質過氧化反應，從而增強細胞膜的通透性，導致正常情況下位于細胞內的酶外流，而ALT和AST主要存在于肝細胞中，所以這2種酶在一定程度上可以反映肝細胞的損傷程度。另外，MDA也是反映肝損傷程度的有效指標，其含量越高說明肝細胞膜脂質過氧化越強，受損越嚴重［10］。再者·CCl3自由基可以抑制細胞膜和微粒體膜的鈣泵活性，鈣離子內流［11］從而導致胞內鈣離子濃度增加。SOD、GSH-Px是體內重要的抗氧化酶類，可以有效清除機體產生的自由基，減弱機體的氧化應激狀態。該研究表明，不同劑量的銀杏多糖可以顯著降低小鼠血清中ALT、AST、MDA含量，并能提高SOD、GSH-Px活性，顯示銀杏多糖對四氯化碳引起的小鼠肝損傷有一定的保護作用，且與濃度直接相關。同時SOD、GSH-Px的活性升高和2種酶活性的升高保持一致關系，暗示銀杏多糖主要通過清除損傷小鼠體內的自由基來對其進行有效保護。

Kupffer細胞(KCs)是肝臟血竇內的常駐細胞，肝臟是門靜脈血流匯入的器官，同時也會帶來抗原、細菌等。而KCs可以去除其中的抗原細菌等異物，同時也會引起炎癥反應。受其他物質的影響(如干擾素γ、白細胞介素-12(IL-2)，KCs會增生、活化，從而釋放出各種胞質變動物質和活性氧，引起肝臟障礙。TNF-α主要有肝臟kuffer細胞和肝實質細胞產生，是肝臟疾病發生和發展的關鍵因素。綜合研究數據發現，TNF-α的水平和肝臟病變的嚴重程度正相關，過高濃度的TNF-α可以誘導肝細胞凋亡和壞死［12，13］。研究發現，抗氧化物質的缺乏可以導致小鼠肝細胞對 TNF-α介導的肝損傷更加敏感［14］。TNF-α對血管內皮細胞產生損害，導致其功能代謝紊亂，在肝實質細胞和Kupffer細胞、肝內皮細胞誘導型NOS合酶的作用下產生NO，而誘導型NO會通過抑制肝細胞翻譯過程和損傷遺傳物質DNA加重肝臟的受損程度，誘導細胞死亡。同時，NO本身作為一種自由基也會加重機體的氧化應激狀態。該研究揭示，銀杏多糖可以有效降低四氯化碳導致的小鼠肝組織中NO、TNF-α的含量，對小鼠肝臟有一定的保護作用。

該研究發現，漯河地區銀杏葉中提取的銀杏多糖得率為4.15%，對四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷導致 ALT、AST、MDA、SOD、GSH-Px的含量增高可以有效抑制，同時能顯著降低肝損傷小鼠血清中NO、TNF-α的含量，提示銀杏多糖可能通過清除誘導小鼠體內自由基、提高抗氧化作用而對誘導小鼠起到保護作用。

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