中藥有效成分對荷視網膜母細胞瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及血清細胞因子水平的影響

陳 卓，于衛江

(鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南省腫瘤醫院藥劑科，鄭州 450008)

調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)包括天然產生的自然調節性T細胞和誘導產生的適應性調節性T細胞，Treg與自身免疫性疾病的發生密切相關，其表達異常可導致自身免疫性疾病。自然調節性T細胞主要為CD4+CD25+Treg，CD4+CD25+Treg除表達CD4+分子和CD25+分子外，其特征標志為其高表達轉錄因子Foxp3。此外，Foxp3還是決定CD4+CD25+Treg功能的關鍵基因。CD4+CD25+Foxp3+Treg能夠抑制小鼠和大鼠的自身免疫性疾病，誘導對移植物的免疫耐受，阻礙抗腫瘤免疫應答的發生，并抑制CD4+CD25+和CD8+T細胞的活化與增殖。

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)系一種原發于視網膜組織的眼內惡性腫瘤，多見于3歲以下幼兒，約89%發生于3歲以前，單眼發病較多約占60%～82%。目前普遍認為，其發病機理是由于抗癌基因的失活才導致細胞惡變的發生。研究發現，導致RB發生的起始原因是視網膜母細胞瘤基因(Rb)的2次突變，并且Rb基因缺失的個體發生RB的幾率比其他腫瘤高2000倍。研究表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg水平升高是腫瘤免疫抑制的重要途徑之一，且荷視網膜母細胞瘤移植鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg的細胞數量與正常小鼠相比明顯高出很多，利于腫瘤耐受的形成，抑制免疫系統對腫瘤的免疫應答，進而促進腫瘤的發生和發展。本文將探討中藥有效成分對荷視網膜母細胞瘤小鼠脾CD+CD25+Foxp3+Treg表達及相關細胞因子水平的影響。

1 材料

1.1 動物

本實驗經過動物倫理委員會的批準，4～6周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠80只，體質量15.64±3.18g，小鼠體質量組間比較差異無統計學意義。由中國醫學科學院實驗動物研究所提供(許可證號SCXK-2005-0013)，中國中醫研究院廣安門醫院動物室喂養(許可證號SYXK(京)2005-0001)。荷視網膜母細胞瘤由中國醫學科學院藥物研究所提供。

1.2 藥物

黃芪、黨參購自河南省食品藥品檢驗所。

1.3 儀器

FACSCalibur分選型流式細胞儀(美國BD公司)、SM800解剖顯微鏡(日本 Canon)、SIAFRT SYNERGYHT多功能酶標儀(美國BIO-TEK)。

1.4 試劑

FITC標記抗小鼠CIM(德國Miltenyi Biotic公司)，APC標記抗小鼠CD25+、PE標記抗小鼠Foxp3(美國EBioscience公司)，流式微球陣列自由組合試劑(IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70，美國 BD 公司)。

2 方法

2.1 動物模型復制

取傳代后12d荷視網膜母細胞瘤荷瘤小鼠，剝離瘤組織，選取生長良好的腫瘤組織，制備荷視網膜母細胞瘤細胞懸液，每只小鼠右腋皮下接種0.2mL(約含活細胞數1×106個)。

2.2 分組給藥

小鼠接種后隨機分為黃芪組、黨參組、黃芪+黨參組和對照組4大組，每大組20只。接種后24h始至處死止每日灌胃給藥1次。荷瘤對照組給予生理鹽水灌胃0.3mL/d，各組中藥浸膏用無菌水稀釋，黃芪組給予黃芪溶液(30mg/kg/d)，黨參組給予黨參溶液(20mg/kg/d)，黃芪 +黨參組給予黃芪溶液(30mg/kg/d)+黨參溶液 (20mg/kg/d)，均為灌胃給藥。

2.3 觀察指標

2.3.1 黃芪、黨參及其組方對小鼠瘤重和體質量的影響 將每大組20只小鼠再隨機分為5d組、10d組、15d組和20d組共4小組，每小組5只。分別于接種后5、10、15、20d處死小鼠，稱荷瘤小鼠體質量剝離腫瘤組織，精確電子天平稱取瘤重。小鼠體質量=荷瘤小鼠體質量－瘤重。

2.3.2 黃芪、黨參及其組方對小鼠抑瘤率的影響 于接種后5、10、15、20d處死小鼠剝離腫瘤組織，精確電子天平稱取瘤重，按下列公式計算抑瘤率。抑瘤率(%)=［1－實驗組平均瘤重(g)/對照組平均瘤重(g)］×100%。

2.3.3 黃芪、黨參及其組方對小鼠荷視網膜母細胞瘤轉移抑制率的影響 將各用藥組及對照組的20d組小鼠處死，剝離小鼠視網膜生理鹽水沖洗，Bouin氏液固定，解剖顯微鏡下觀察荷視網膜母細胞瘤轉移灶個數。荷視網膜母細胞瘤轉移抑制率(%)=［1－實驗組平均荷瘤轉移灶個數(個)/對照組平均荷瘤轉移灶個數(個)］×100%。

2.3.4 黃芪、黨參及其組方對荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表達的影響 于接種后5、10、15、20d摘眼球取血，斷頸處死小鼠酒精消毒皮膚，迅速取脾、稱重、研磨，200目濾網濾過包膜及脂肪組織等，加入2mL PBS，收集脾細胞懸液計數細胞，取約1×106個細胞重懸于100μL PBS中，按照試劑說明書進行FITC-CD4、APC-CD25染色、破膜，PE-Foxp3染色上機檢測。

2.3.5 血清細胞因子水平檢測 (1)樣本采集:于接種后20 d小鼠摘眼球取血，室溫凝固4h，4000r/min離心20min，收集上清待測;(2)小鼠血清 IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-γ 水平用流式微球陣列技術 (CBA)檢測。①儀器調整:使用CBA FLEXSET試劑盒中的Cytometer Setup Beads設定參數;②標準品制備:使用CBA FLEX-SET試劑盒中的細胞因子標準品按照梯度法稀釋為6000、3000、1500、1250、715、357、178、89、45、0ng/L10 個濃度;③制備樣品及分析:取待測血清50μL置于PE管，加入50μL捕獲微球混合物，50μL PE標記檢測抗體，室溫避光孵育4h，加入2mL洗液，150g×6min洗2次，加入200μL洗液上機檢測，BD CBA軟件進行數據分析。

2.4 統計學方法

應用SPSS 11.0軟件統計分析，數據結果以均值±標準差(珋x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠瘤重及體質量動態變化

20d黃芪組和黃芪+黨參組荷瘤小鼠瘤重分別為(3.38±1.53)g、(2.97 ±1.36)g，明顯低于荷瘤對照組小鼠瘤重(4.14±1.86)g(P＜0.05)，15d黃芪+黨參組荷瘤小鼠瘤重(2.73±1.27)g低于荷瘤對照組小鼠瘤重(3.68±1.83)g(P＜0.05)，其他各時間點各組瘤重無差異。各組小鼠體質量隨天數的增加呈下降趨勢，20d黃芪組體質量(17.06±2.53)g高于荷瘤對照組(12.95±1.74)g(P＜0.05)，20d黃芪+黨參組體質量(17.48±2.16)g高于荷瘤對照組(12.95±1.74)g(P＜0.05)，其他各時間點各組體質量無差異。

3.2 荷瘤小鼠抑瘤率動態變化

表1顯示，黃芪組小鼠和黃芪+黨參組小鼠腫瘤抑制率均明顯高于黨參組小鼠的腫瘤抑制率(P＜0.01)，而各時間段黃芪組小鼠腫瘤抑制率與黃芪+黨參組比較差異無統計學意義。各中藥有效成分組抑瘤率在用藥前期較為可觀，但隨著給藥天數的增加，各中藥有效成分組抑瘤率逐漸下降。

表1 各組腫瘤抑制率比較(%，n=5)

3.3 荷瘤小鼠荷視網膜母細胞瘤轉移抑制率

表2顯示，20d黃芪+黨參組荷視網膜母細胞瘤轉移抑制率為46.61%，視網膜母細胞瘤轉移灶個數顯著低于荷瘤對照組、黃芪組及黨參組(P＜0.01)。

3.4 荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表達動態變化

圖1、表 3顯示，對照組小鼠 CD4+CD25+Foxp3+Treg表達隨荷瘤天數的增加呈上升趨勢，各中藥組小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表達在腫瘤病程中均呈下降趨勢。20d小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg表達3個中藥組低于荷瘤對照組(P＜0.05)，15d黃芪+黨參組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達低于荷瘤對照組(P＜0.05)。

表3 各組荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比動態變化(%，珔x ± s，n=5)

圖1 各組荷瘤小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比變化直方圖

3.5 荷瘤小鼠血清細胞因子水平比較

表4顯示，黃芪組、黨參組和黃芪+黨參組小鼠血清IL-10水平均低于荷瘤對照組(P＜0.05);黃芪組、黨參組和黃芪+黨參組小鼠血清IL-2及IFN-γ水平均高于荷瘤對照組(P＜0.05)，而IL-6、IL-12p70水平各組與荷瘤對照組比較差異無統計學意義。

4 討論

早在20世紀90年代初，就有報道人類腫瘤中有一類起抑制作用的T細胞，但直到20世紀90年代中期，Treg被分離出后，關于人類腫瘤中Treg是否增多的研究才逐漸增多。Woo等首次報道在非小細胞肺癌和卵巢癌的腫瘤浸潤淋巴細胞中Treg增多。這些Treg分泌TGF-β為Treg導致機體免疫低反應性首次提供依據。Curiel等證明，在卵巢癌患者中，CD4+CD25+Foxp3+Treg抑制腫瘤特異性T細胞的免疫活性，有助于腫瘤的生長、進展。又有Larmonier研究證實，荷瘤小鼠體內Treg數目增多。Treg通過下調轉錄核因子-κB的活性來影響樹突狀細胞的功能，而被抑制的樹突狀細胞表面CD80、CD86和CD40的表達水平及分泌產生的IL-2、TNF-α均顯著降低，使之發揮免疫負性調節作用。臨床研究也表明，腫瘤復發則患者體內Treg數目有明顯增高，腫瘤增長與Treg細胞數目之間有明顯關系。在本研究中，黃芪和黨參的中藥組方明顯下調荷瘤小鼠IL-10的水平及CD4+CD25+Foxp3+Treg表達，可能是與化療藥物類似，通過抑制腫瘤微環境中的血管生成，促進Treg凋亡，使Treg數目減少，T細胞和NK細胞的作用恢復，從而起到有效控制腫瘤的作用。CD4+CD25+Foxp3+Treg的減少導致IL-10的分泌量減少，從而抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg參與腫瘤免疫逃逸及對機體免疫的抑制作用。

表4 20d各組小鼠血清細胞因子水平比較(ng/L，珔x±s，n=5)

中醫認為氣虛是腫瘤的重要病理因素，黃芪屬于傳統益氣中藥，在體內具有廣泛的免疫增強作用;黨參具有補中益氣之功效，含有萜類、糖和糖苷類、甾體類等多種化學成分，有提高機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤等功能。本研究中，黃芪組和黃芪+黨參組在改善荷瘤小鼠體質量及抑瘤率方面具有明顯功效，而在抑制腫瘤轉移方面則以黃芪+黨參組為最佳。同時3個中藥組都能明顯下調CD4+CD25+Foxp3+Treg百分比，不同中藥對荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg表達的變化趨勢有不同影響。黃芪+黨參組方較其單味藥黨參、黃芪有較好的抑瘤、抗轉移、下調 CD4+CD25+Foxp3+Treg表達、下調IL-10水平的作用。綜合以上結果可以認為，中藥黃芪+黨參組方可明顯抑制腫瘤的發生與發展，并可有效改善機體的細胞免疫效應，這一結果也可為研究者探析中藥及其組方的抑癌機制及在改善西醫化療效果方面提供一些新思路和新對策。

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