IFN－γ基因啟動子甲基化與慢加急性肝功能衰竭的相關性研究

李鳳彩，李月凱

慢加急性肝功能衰竭是慢性肝病基礎上出現的以黃疸急劇加深、凝血功能障礙為特征的肝功能失代償［1］。IFN－γ是一個重要的免疫反應調控因子，主要由活化的Th1細胞和NK細胞產生。最近研究表明慢加急性肝功能衰竭患者IFN－γ水平升高，IFN－γ可引起肝臟炎癥，參與慢加急性肝功能衰竭的發病過程［2］。

甲基化是表達遺傳的一種重要機制，是指在DNA甲基轉移酶(DNMTs)的介導下，以5－腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將胞嘧啶加上一個甲基變為5－甲基胞嘧啶的一種化學修飾過程，可導致基因的表達異常但DNA序列不發生改變［3］，異常甲基化會導致很多疾病的發生。本研究通過測定慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ基因啟動子甲基化狀態，探討IFN－γ基因啟動子甲基化與慢加急性肝功能衰竭病情嚴重指標的關系，為慢加急性肝功能衰竭的發病及預后提供新的思路。

1 資料與方法

1．1 研究對象 慢加急性肝功能衰竭患者20例。其中男17例，女3例;平均年齡(45.9±11.3)歲。診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》。排除標準:①急性妊娠脂肪肝;②藥物性肝炎，酒精性肝炎(男性＞40g/d至少5年;女性＞20g/d至少5年);③懷疑免疫性肝病，肝豆狀核變性(Wilson病)等代謝性肝病;④移植術后再感染乙肝導致重型肝炎者;⑤確有原發性肝癌病史;⑥有肝炎以外嚴重疾病史，包括嚴重的心臟、肺、腎臟、消化、神經、精神疾病、免疫調節性疾病、代謝性疾病或惡性腫瘤等。

1．2 方法 甲基化特異性PCR(MSP)反應:取新鮮外周靜脈血5 ml，肝素抗凝(25 U/ml)，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PMBc)，按照德國QIAGEN公司的DNA提取試劑盒步驟提取DNA，按照上海杰美公司的DNA甲基化修飾試劑盒步驟進行DNA轉化，運用MSP擴增，根據Methprimer軟件設計引物，序列如下:M引物:5’－AAGAGTTAATATTTTATTAGGGCGA －3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAATCCTTTAACGAT －3’(下游引物)，U引物:5’－TGAAGAGTTAATATTTTATTA GGGTGA－3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAA TCCTTTAACAAT－3’(下游引物)。引物由上海生物工程公司合成。PCR反應條件:預變性95℃ 3 min，95℃變性45 s，52℃退火1 min，72℃引物延伸45 s，共運行35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取8μl PCR擴增產物加樣后，進行電泳，條件為120 V，35 min。電泳結束后，在紫外線下觀察結果并用凝膠電泳圖像分析系統分析結果。

1．3 統計學分析 采用SPSS13.0軟件包進行，結果用均數±標準差±s)表示，組間顯著性分析采用兩組獨立樣本資料的χ2檢驗，P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果

2．1 IFN－γ基因啟動子的甲基化狀態 在研究中，筆者用甲基化特異性PCR法(MSP)測定了慢加急性肝功能衰竭患者的甲基化程度，結果顯示:20例慢加急性肝功能衰竭患者，IFN－γ甲基化者12例，非甲基化者為8例。

2．2 IFN－γ基因啟動子甲基化與病情嚴重指標的關系 慢加急性肝功能衰竭的診斷需要滿足血清TBIL＞170μmol/L或每天上升速度＞17.1μmol/L，血漿凝血酶原活動度(PTA)＜40%。終末期肝病模型(MELD)評分系統最早是由于決定肝臟移植器官分配的優先權的需要而提出的，是判斷肝衰竭患者預后的評價體系。該系統是利用血清膽紅素(TBIL)、血肌酐(Cr)、凝血酶原時間的國際標準化比值(INR)及原發病因作為參數進行量化而得出分值。MELD評分系統對肝衰竭患者的預后和生存率有良好的預測價值。本研究將TBIL、PTA、MELD評分作為評價ACLF患者病情嚴重程度的指標，分析兩組間TBIL、PTA、MELD評分，測得IFN－γ甲基化組TBIL水平明顯低于非甲基化組(P＜0.01)，見圖1。并測得IFN－γ甲基化組與非甲基化組比較PTA水平無統計學差異(P＞0.05)，見圖2。再者，甲基化組MELD水平明顯低于非甲基化組(P ＜0.01)，見圖3。

圖1 兩組TBIL水平比較

圖2 兩組PTA水平比較

圖3 兩組MELD評分比較

3 討論

本研究所測得慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ甲基化程度不同，而且不同的IFN－γ甲基化伴有不同的慢加急性肝功能衰竭病情嚴重程度指標TBIL水平、MELD評分的不同。

前人研究表明IFN－γ參與慢加急性肝功能衰竭的發病。孫穎等［3］曾報道，慢加急性肝功能衰竭患者的肝臟組織的IFN－γ水平明顯升高。Ohta等［4］報道，在重型肝炎的發病機制中，抗原特異性Thl分泌的IFN－γ起重要作用。姜榮龍等［5］報道，在慢性肝炎患者的外周血中，Th2細胞占大多數，Th1細胞占少數，但隨著肝臟炎癥活動的加劇，Th1細胞比例則明顯增加。當Th1細胞亞群占優勢時，其分泌的細胞因子IFN－γ可通過直接或間接的作用增強NK細胞、巨噬細胞活性，特別是CD8+細胞活性，促進細胞免疫反應，加重肝臟的炎癥損傷［6］。

Melvin等［7］分析了T細胞系 IFN－γ基因啟動子區甲基化狀態和其表達的關系后發現，IFN－γ基因啟動子甲基化程度高時，IFN－γ基因低表達，反之，IFN－γ基因啟動子甲基化程度低時，IFN－γ基因高表達，即IFN－γ基因表達水平和甲基化程度之間存在明顯負相關。Yano等［8］研究了Th1和Th2細胞的IFN－γ基因啟動子的甲基化狀態后也得出了相似的結論，Th1的基因啟動子是低甲基化的，Th1細胞可產生IFN－γ，而Th2的基因啟動子是高甲基化的，Th2細胞不可產生IFN－γ，為了進一步證實甲基化對于基因轉錄的調控作用，Yano用5’－氮胞苷處理Th2細胞，以抑制組蛋白去乙?；刚心嫉交騿幼訁^而抑制甲基化形成，從而導致Th2細胞IFN－γ基因啟動子去甲基化，結果發現處理后的Th2細胞能夠分泌IFN－γ。

綜上所述，IFN－γ啟動子甲基化通過影響IFN－γ水平參與慢加急性肝功能衰竭的發病并影響其嚴重程度。

［1］中華醫學會感染病分會肝衰竭及人工肝學組，中華醫學會肝病分會重型肝病與人工肝學組．肝衰竭診療指南［J］．中華肝臟病雜志，2006，14(9):643 －646．

［2］孫 穎，李保森，徐東平，等．肝內IFN－γ及其分泌細胞在乙型慢加急性肝衰竭發病機制中的作用［J］．傳染病信息，2008，21(4):227－230．

［3］Wolffe AP．Epigenetics:regulation through repression［J］．Science，1999，286(4):481 －486．

［4］Ohta A，Sekimoto M，Sato M，et al．Indispensable role of TNF － alpha and IFN－gamma at the effector phase of liver injury mediated by Th1 cells specific to hepatitis B virus surface antigen［J］．J Immunol，2000，165(2):956 － 961．

［5］姜榮龍，盧橋生，駱抗先，等．慢性乙型病毒性感染者外周血T輔助細胞1、2型因子的表達［J］．中華傳染病雜志，2000，18(1):26－28．

［6］Milich DR，Chodel FS，Hughes JL，et al．The hepatitis B virus core and eantigens elicit different Th cell subsets:antigen structure affect Th cell phenotype［J］．JVirol，1997，71(20):2192 －2201．

［7］Melvin AJ，McGurn ME，Bort SJ，et al．Hypomethylation of the interferon－gamma gene correlates with its expression by primaryT－lineage cells［J］．Eur J Immunol，1995，25(4):426 －430．

［8］Yano S，Ghosh P，Kusaba H，et al．Effect of promoter methylationon the regulation of IFN－gamma gene during in vitro differentiation of human peripheral blood T cells into a Th2 population［J］．J Immunol，2003，171(24):2510 －2516．