采用組織芯片研究非小細胞肺癌中腫瘤轉移相關基因1、血管內皮生長因子C的表達及意義

孫向東 王曉萍 汪 棟

1.解放軍第八一醫院全軍腫瘤中心腫瘤放射治療科，江蘇南京 210000；2.解放軍第八一醫院全軍腫瘤中心心胸外科，江蘇南京 210000

肺癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，嚴重威脅人類健康[1]。腫瘤的侵襲和轉移是腫瘤的重要生物學行為特征，也是患者死亡的最主要原因。淋巴結轉移是非小細胞肺癌重要的轉移途徑，血管內皮生因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是特異性的新生淋巴管刺激因子，能夠促進毛細淋巴管的新生并增加淋巴管內皮的通透性，從而導致腫瘤轉移更易發生[2]。腫瘤轉移相關基因（metastasis-associated gene 1，MTA1） 是 MTA（metastasisas sociated）家族成員之一，被認為是核小體重構及組蛋白脫乙酰基酶復合物的組成部分，其表達的增高與多種上皮性惡性腫瘤的侵襲轉移密切相關[3]。本實驗對MTA1和VEGF-C的表達進行檢測，結合臨床、病理資料，分析它們與臨床因素之間的相關性，探討它們與非小細胞肺癌侵襲和轉移之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集解放軍第八一醫院全軍腫瘤中心2008年1月～2010年3月的186例肺癌切除手術標本。男137例，女49例，年齡31～75歲，中位年齡55歲。肺鱗癌105例，其中低分化42例，中分化37例，高分化26例。肺腺癌81例，其中低分化35例，中分化32例，高分化14例。TNM分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期72例，Ⅲ期61例，Ⅳ期13例。同時收集23例距腫瘤邊緣＞5 cm處的正常肺組織為對照。

1.2 試劑

羊抗人MTA1多克隆抗體和VEGF-C多克隆抗體均購自Santa Cruz公司，即用型免疫組化超敏S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物試劑開發公司。檸檬酸抗原修復緩沖液、PBS緩沖液、蘇木素染色劑、中性樹膠封片劑、多聚賴氨酸、石蠟、各種濃度乙醇、甲醛等，均來自解放軍第八一醫院病全軍腫瘤中心的病理科。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制作 從病理科的存檔中選取各型非小細胞肺癌蠟塊，同時調閱相應的HE染色組織切片及患者的病歷資料，同時新近收集肺癌及正常肺組織制備組織蠟塊。將所有非小細胞肺癌組織蠟塊分類登記，按文獻要求進行設計[4]。對每一組織標本，均先觀察蘇木精-伊紅切片以確定腫瘤部位，每一例肺癌蠟塊選取4點、正常組織蠟塊選取2點，共制成20×12陣列塊。

1.3.2 免疫組化方法 采用S-P方法，檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復。在染色中，各種抗體染2張TMA的連續切片。另外還選擇了10例相應非小細胞肺癌組織標本，作常規HE切片染色來驗證組織代表性。陰性對照以PBS代替一抗。陽性對照以相應抗體的已知陽性切片作對照。結果判定：以非小細胞肺癌胞核或胞漿內出現黃色至棕褐色顆粒，定位較明確、染色明顯的切片視為表達陽性。表達強度的分析，筆者采用每個切片選取5個視野，Image-Pro Plus（Media Cybe Netics Inc，USA）圖像分析系統進行分析，測算單位面積平均光密度（OD）值。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 12.0處理。計數資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTA1蛋白的表達

MTA1蛋白表達定位于非小細胞肺癌的細胞核，呈明顯的棕黃色顆粒狀。23例正常肺組織中均無陽性表達。在186例非小細胞肺癌中，共有陽性染色103例（陽性率為62.8%）；其中有淋巴結轉移的117例非小細胞肺癌中，MTA1表達陽性的共有83例（陽性率為70.9%），無淋巴結轉移的69例非小細胞肺癌中，MTA1表達陽性的共20例（陽性率為29.0%）。MTA1蛋白的表達與腫瘤病理學各參數間的關系見表l。MTA1蛋白陽性表達在年齡、性別、病理組織類型方面無差異，但是在非小細胞肺癌的TNM分期、分化程度以及淋巴轉移情況等方面差異有統計學意義（P ＜0.05）。 見圖1、表1。

2.2 VEGF-C的表達

VEGF-C蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細胞漿。在186例中有119例染色陽性（64.0%），23例正常肺組織中4例陽性表達（17.4%），兩者比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）。有淋巴結轉移的117例非小細胞肺癌中，VEGF-C陽性者共98例（陽性率為83.8%），無淋巴結轉移的69例非小細胞肺癌中，VEGF-C陽性表達共21例（陽性率為30.4%）。VEGF-C蛋白的陽性表達與腫瘤病理學各種參數間的關系參見表l。VEGF-C蛋白的陽性表達在年齡、性別、病理類型、分化程度方面差異無統計學意義（P＞0.05），但是在非小細胞肺癌TNM分期、淋巴結轉移情況等方面差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2、表1。

2.3 MTA1蛋白和VEGF-C蛋白陽性表達的相關性

對MTA1、VEGF-C蛋白表達OD值進行了Pearson相關分析，結果表明兩者有相關性（r=0.175，P＜0.01）。

表1 MTA1和VEGF-C在非小細胞肺癌中的表達[n（%）]

3 討論

肺癌的五年生存率僅為16%[5]，而非小細胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌的80%。影響生存的主要原因是肺癌的浸潤和轉移。肺癌淋巴結轉移狀態是一個重要的預后因素，由于肺內淋巴系統發達，極易發生淋巴結轉移。因此，闡明肺癌淋巴結轉移的分子機制有著重要的臨床意義。

VEGF-C是被公認的促淋巴管生成因子，主要通過其受體VEGFR-2和VEGFR-3發揮作用，可促進腫瘤微淋巴管生成及腫瘤細胞向區域淋巴結的轉移，并且能夠通過淋巴系統向全身各處進行廣泛的轉移與擴散[6]。Weryńska等[7]研究表明，腫瘤細胞能夠促進淋巴管生成的調控因子VEGF-C的表達，從而誘導淋巴管新生，被誘導生成的淋巴管進一步促進了腫瘤淋巴結的轉移狀況。VEGF-C還可以促進淋巴內皮細胞在腫瘤細胞密集區內的大量生成，同時可以導致淋巴管明顯擴張，由于新生微淋巴管的結構尚沒有發育完善，依然是高滲漏的狀態，從而利于腫瘤細胞滲漏入淋巴管，導致轉移的發生[8]。

筆者研究顯示，非小細胞肺癌組織中VEGF-C的陽性表達率為64.0%，正常組織為17.4%。兩者比較差異有統計學意義（P＜0.01），提示VEGF-C在NSCLC的發生中起重要作用。VEGF-C在性別、年齡、病理組織類型、分化程度方面無差異；VEGF-C蛋白的陽性表達與非小細胞肺癌的TNM分期、淋巴結轉移均有顯著相關性（P＜0.01），說明VEGF-C蛋白在腫瘤的浸潤轉移中起著顯著的作用。

腫瘤轉移相關基因1（MTA1）是一個在腫瘤轉移過程中表達上調的基因，1993年第一次應用差異雜交的技術，從鼠乳腺癌細胞株13762NF中分離出一種新的乳腺癌轉移相關基因[9]。隨后，Toh等[10]應用Southern技術，找到了其相應的同源基因，該基因的表達與乳腺癌轉移能力呈正相關，故被命名為MTA1。現已證實MTA1與各種腫瘤的轉移密切相關，并且在信號轉導通路中起到相應的作用。Yu等[11]檢測INSCLC中MTA1蛋白表達水平，結果提示，該基因的表達與NSCLC的分化程度密切相關，而與患者的年齡、性別和病理類型無相關性。Song等[12]應用免疫組化方法檢測了174例食管癌中MTA1表達，發現MTA1在淋巴結轉移患者的過度表達顯著高于無淋巴結轉移患者。

本研究應用免疫組織化學法檢測186例NSCLC患者癌組織中和23例正常肺組織中MTA1蛋白的表達情況，MTA1在非小細胞肺癌的正常肺組織未見表達。在癌組織中的陽性表達者為103例（55.4%），與正常組織相比，差異有統計學意義（P＜0.01），提示了MTA1基因在非小細胞肺癌的發生和發展過程中起到了一定作用；而在不同性別、年齡及組織學類型中的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。另外，本研究發現，MTA1蛋白在低分化癌組織中的陽性表達率明顯高于中高分化組織（P＜0.05），說明MTA1蛋白表達與肺癌的分化程度密切有關，提示MTA1蛋白可能與抑制癌細胞的分化成熟有關；經臨床病理分析發現，MTA1蛋白的表達水平與臨床分期及淋巴轉移有關，提示MTA1的表達與非小細胞肺癌的惡性程度、局部的侵襲轉移及淋巴轉移有關，MTA1高表達的非小細胞肺癌具有更強的侵襲及轉移能力。

筆者進行的研究顯示，TNM分期晚，并且有淋巴結轉移的肺癌，MTA1、VEGF-C蛋白的陽性表達明顯高于TNM分期早并且沒有淋巴結轉移者，尤其是兩者相關性分析提示，非小細胞肺癌中MTA1表達與VEGF-C表達呈正相關關系，由此推斷，MTA1與肺癌的發生、發展及淋巴結轉移密切相關，其促進侵襲與淋巴結轉移的機制可能與VEGFC有關，但兩者的進一步關系尚需實驗研究來證實。

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