高效的紅細胞特異性表達系統的建立和優化

潘 欣，田 愛，王熙才，狄升蒙，張勝男，張艷磊，易紅飛，趙曉杰，黃 進，張鴻聲

血友病B是一種人凝血因子Ⅸ(human factorⅨ，hFⅨ)基因缺陷引起的X染色體連鎖隱性遺傳的出血性疾病。目前使用的蛋白替代療法(protein replacement therapy)雖能提高患者生存質量、延長壽命，但需終生用藥，且存在經濟和血液安全等多方面問題。部分患者會產生抗體，中和外源hFⅨ;一些重癥患者因為基因突變，免疫系統不能耐受治療性蛋白，而將其作為新的抗原遞呈給免疫系統，導致無效治療，出血難以控制[1]:這些因素迫使研究人員采用新的治療策略。人體hFⅨ的質量濃度正常生理水平為5 000 ng/ml，血漿hFⅨ質量濃度達到正常值的1%就可減輕癥狀，達到5%可基本正常生活，達到25%可完全正常學習工作，即相對溫和地增加較少的基因產物，患者就可以獲得顯著的治療收益，因而血友病成為基因治療研究的首選疾病模型[2]。

能夠與宿主基因組整合的病毒系統目前仍是主導血友病基因治療研究領域的重要工具。以人類免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)為代表的自滅活(self-inactivation，SIN)慢病毒載體(lentiviral vector，LV)既可感染分裂細胞，也可感染非分裂細胞，具有攜帶基因片段容量較大、目的基因長時間穩定表達、不易誘發宿主免疫反應等優勢，已成為基因治療中較理想的基因轉移載體。使用紅細胞特異性慢病毒載體可使導入的hFⅨ在造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)向紅細胞分化過程中長期分泌[3]。

本研究使用的LV是第3代三質粒表達載體[4]，其中轉移質粒(transfer plasmid)中 3'LTR(長末端重復序列)刪除U3區增強子和啟動子序列，使載體不再有HIV-1啟動/增強活性，成為可攜帶外源基因的SIN慢病毒載體。

小鼠紅白血病(murine erythroleukemia，MEL)細胞是弗氏病毒感染敏感小鼠脾臟后細胞轉化獲得的原紅細胞株(proerythroblast)。MEL細胞在培養過程中，當加入環六亞甲基雙乙酰胺(N，N'-hexamethylene bisacetamide，HMBA)或二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)等化學誘導劑時，可向紅系終端分化為成熟的紅細胞[5-6]。MEL細胞的這種特性為在終末分化期間研究基因表達變化特征提供了一個適合的模型。由于紅細胞的發生有可誘導性，且分化終端不含細胞核、不攜帶基因組，可以進一步提高慢病毒轉染紅系祖細胞后誘導分化終產物的安全性，因此成為本研究中的細胞模型。

為了控制外源基因過表達，本研究構建了一系列紅細胞特異性基因調控元件控制hFⅨ表達的慢病毒載體，旨在通過適當減少調控元件，優化慢病毒載體，從而提高攜帶外源基因片段的長度，增加載體制備的有效性，并充分滿足外源基因表達在治療水平的需求量。本研究還探討了藥物篩選在富集重組慢病毒感染陽性細胞中的重要作用，為今后利用紅細胞特異性重組慢病毒載體在動物實驗中開展靶向基因治療的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒 大腸埃希菌DH5α、包裝質粒psPAX2、包膜蛋白質粒 pMD2.G、轉移質粒 RT9-hFⅨ-SI-MGMT[以下簡稱RT9;MGMT為甲基鳥嘌呤甲基轉移酶(methylguanine methyltransferase)]、轉移質粒 RS9-hFⅨ-SI-MGMT(以下簡稱 RS9)、轉移質粒RT10-hFⅨ-SI-MGMT(以下簡稱RT10)，上海市肺科醫院臨床轉化中心實驗室保存。

1.1.2 細胞系 人腎胚胎(human embryonic kidney，HEK)293T細胞、MEL細胞、小鼠成纖維細胞NIH/3T3、穩定表達對照病毒 RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細胞，上海市肺科醫院臨床轉化中心實驗室保存。

1.1.3 試劑 各種限制性內切酶為美國New England Biolabs公司產品，達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)、AIMV培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)為美國Invitrogen Gibco公司產品，O6-芐基鳥嘌呤(O6-benzylguanine，BG)、卡莫司汀[1，3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU]、HMBA、聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、聚凝胺(polybrene)、L-谷氨酰胺和小鼠抗人hFⅨ單抗為瑞士Sigma公司產品，青霉素和鏈霉素溶液(以下簡稱雙抗)為美國Hyclone公司產品，InstaGene Matrix為美國Bio-Rad公司產品，熒光定量(TaqMan)快速聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)混合試劑盒(2×)為美國ABI公司產品，哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑(mammalian protein rxtraction reagent，M-PER)、2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析試劑盒為美國Pierce公司產品，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG為加拿大Affinity Biologicals公司產品，辣根過氧化物酶的2，2-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2，2-Azinobis-(3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic-acid)diammonium salt，ABTS]底物為美國Zymed公司產品。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒轉移載體的設計和制備 RT10的結構(圖1 RT10)中，編碼hFⅨ的cDNA和一段短內含子受 β-珠蛋白啟動子(promoter，P;707 bp)、β-珠蛋白 3'端增強子(enhancer，E;約 879 bp)、β-珠蛋白內含子IVS2(約476 bp)和β-珠蛋白位點控制區(locus control regions，LCR)調控。載體中的LCR結構包括:1 072 bp的 HS4，1 296 bp的 HS3，839 bp的HS2，1 089 bp的HS1。由人類磷酸甘油酸激酶啟動子(phosphoglycerate kinase promoter，PGK-P)控制的MGMT-P140K突變基因cDNA位于載體的3'-末端。應用不同的限制性內切酶及DNA重組技術構建各種以hFⅨ為目的基因、由不同調控元件控制、由RT10衍生的慢病毒轉移載體。

1.2.2 重組慢病毒包裝 用三質粒系統瞬時轉染HEK 293T細胞制備皰疹性口炎病毒的包膜糖蛋白(vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein，VSV-G)假型慢病毒顆粒[7]。當HEK 293T細胞在10 cm細胞培養皿中生長達80%～90%匯合時，棄含雙抗(青霉素終質量濃度為50 U/ml，鏈霉素終質量濃度為50 mg/ml)的完全DMEM培養基(含10%FBS)，用PEI轉染三質粒混懸液(在1 ml無血清無抗生素DMEM 中混合 1 μg psPAX2、2 μg pMD2.G、4 μg 轉移質粒和24 μl pH 7.0 的1 μg/μl PEI)于用9 ml含

10%FBS和2 mmol/L L-谷氨酰胺的完全培養基覆蓋的HEK 293T細胞。24 h后棄上清，換預熱的新鮮完全培養基，分別于48 h和96 h收獲細胞培養上清中的病毒液，500×g 10 min除去脫落的細胞和大的細胞碎片，用0.45 μm濾器過濾上清，濾液經8 500×g 12 h離心濃縮病毒顆粒。用無血清AIMV培養基重懸病毒顆粒，分裝至凍存管，－80℃保存備用。重組慢病毒以載體名稱命名。

1.2.3 重組慢病毒滴度測定 用終質量濃度為8 μg/ml Polybrene介導重組病毒顆粒轉染小鼠成纖維細胞NIH/3T3，培養7 d后，用InstaGene Matrix抽提基因組 DNA。穩定表達對照病毒 RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細胞基因組為對照。兩套引物、探針聯合使用，采用多重TaqMan PCR檢測病毒滴度[8]。慢病毒序列檢測所用的引物探針為:正向引物 GAG-F，5'-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3';反向引物GAG-R，5'-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTGTC-3';探針 GAG-P，5'-[FAM]ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG[TAMRA]-3'。小鼠 β-actin(簡稱 BAC)為內源性對照，正向引物 BAC-F，5'-GGCACCACACCTTCTACAATG-3';反向引物BAC-R，5'-GGGGTGTTGAAGGTCTAAAC-3';探針 BAC-P，5'-[HEX]TGTGGCCCCTGAGGAGCACCC[BHQ1]-3'。使用美國Applied Biosystems公司的7500 PCR儀，每個定量PCR反應中基因組DNA總共使用100 ng(1×TaqMan快速PCR混合試劑，500 nmol/L基因特異性正、反向引物和探針)，每組反應設3個重復。在SDS 2.1軟件中設置定量PCR反應程序為95℃ 10 min熱啟動;PCR反應 94℃ 15 s，60℃ 1 min，共 40 個循環[9]。

已知穩定表達對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3每個細胞有1個慢病毒載體拷貝數(vector copy number，VCN)，其基因組DNA用未感染慢病毒的NIH/3T3細胞基因組DNA進行5倍系列稀釋后，通過定量PCR，獲得慢病毒轉染的VCN。病毒滴度(titer，T)計算公式:T(U/ml)=VCN×稀釋倍數×起始細胞數[10]。

1.2.4 BG-BCNU篩選 為有效富集陽性轉染細胞的比例，MEL細胞經重組慢病毒轉染后，先與指定濃度的BG孵育1 h，再加指定濃度的BCNU于37℃共孵育1 h。其中BG終濃度在各實驗組中均保持恒定，為50 μmol/L，對照組BG 終濃度為0 μmol/L;BCNU 終濃度分別為 0、25、50、100 μmol/L;1 h 后換預熱的不含藥物的新鮮培養基，以后每3 d換1次培養液，移除懸浮細胞。篩選14 d后進行后續實驗。

MEL細胞在用5 mmol/L HMBA誘導的第0天，收獲1×106cells，抽提基因組DNA，用多重Taq-Man PCR檢測病毒滴度，以評估BCNU有效篩選的終濃度。

1.2.5 免疫檢測hFⅨ的濃度 取BG-BCNU篩選后的細胞，用5 mmol/L HMBA誘導8 d，誘導過程中每日收獲1×106cells，抽提細胞總蛋白，hFⅨ在細胞樣品中的濃度用酶聯免疫吸附測定(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測。簡單地說，96孔板用小鼠抗人hFⅨ單抗1∶800包被。各孔用含5%FBS的磷酸緩沖液封閉。細胞總蛋白樣品用含2%FBS的磷酸緩沖液稀釋到標準曲線線性范圍內的濃度。辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，1∶800稀釋。加入ABTS底物后，96孔板在單波長415 nm處檢測。

1.3 統計學處理 數據使用GraphPad Prism 5軟件進行配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅細胞特異性慢病毒表達載體的構建和鑒定限制性酶譜鑒定和測序分析結果顯示，紅細胞特異性慢病毒表達載體 RT10、RT9、RS9、RT9-HS4(－)、RT9-IVS2(－)和RT9-E(－)，包裝質粒 psPAX2和包膜蛋白質粒pMD2.G結構均正確。重組慢病毒載體中RT10包含完整的調控元件，即編碼人hFⅨ的cDNA和一段短內含子由β-珠蛋白啟動子、β-珠蛋白3'端增強子和β-珠蛋白基因位點控制區調控，MGMT-P140K突變基因由人PGK-P控制;RT9刪除了LCR的HS1元件;RS9在RT9基礎上將β-珠蛋白啟動子從707 bp刪減到315 bp;RT9-HS4(－)是在RT9基礎上又刪除了LCR中的HS4元件;RT9-IVS2是在RT9基礎上刪除了β-珠蛋白內含子IVS2部分序列;RT9-E(－)是在RT9基礎上刪除了β-珠蛋白3'端增強子(圖1)。

圖1 慢病毒轉移質粒結構圖

2.2 重組慢病毒滴度檢測 重組慢病毒載體分別與包裝質粒psPAX2和包膜蛋白質粒pMD2.G經PEI介導瞬時共轉染293T細胞獲得重組慢病毒，經8 500×g 12 h離心濃縮后，用多重TaqMan PCR測得重組慢病毒滴度如圖2所示。

圖2 重組慢病毒滴度

RT9的滴度是(2.47±0.28)×106U/ml;RT10的滴度是(2.78±0.20)×106U/ml，是RT9的1.12倍(P=0.294 6);RS9的滴度是(3.28±0.44)×106U/ml，是RT9的1.33倍(P=0.190 7);RT9-HS4(－)的滴度是(2.36±0.25)×106U/ml，是 RT9的 0.96倍(P=0.575 6);RT9-IVS2(－)的滴度是(2.30±0.67)×106U/ml，是 RT9 的 0.93 倍(P=0.584 9);RT9-E(－)的滴度是(2.42±0.58)×106U/ml，是 RT9的0.98倍(P=0.883 8)。6組重組慢病毒滴度兩兩之間差別均無統計學意義(P=0.132 7)，提示適當刪除部分調控元件不影響病毒包裝效率。

2.3 BCNU對病毒滴度的影響 為了檢測BCNU篩選所需的有效濃度，各組以復合感染(multiplicity of infection，MOI)=10的重組慢病毒轉染MEL細胞，經0 μmol/L 或50 μmol/L 的 BG 處理1 h后，再分別加0 μmol/L 的 BCNU 或 25、50、100 μmol/L 的BCNU共孵育1 h，換不含藥物的完全培養基篩選14 d，用多重TaqMan PCR檢測病毒滴度，結果如圖3。隨著BCNU濃度的升高，被藥物選擇出來的細胞中病毒滴度與未選擇細胞0 μmol/L BG-0 μmol/L BCNU相比明顯增加。當使用BCNU的濃度達到25 μmol/L 時(圖 3)，RT9、RT10、RS9、RT9-HS4(－)、RT9-IVS2(－)和RT9-E(－)的重組病毒滴度分別是未選擇細胞的 23.9、8.59、12.59、3.72、1.23、12.48倍(P=0.002 7);50 μmol/L時，是未選擇細胞的29.6、13.36、11.07、3.61、1.60、12.95 倍 (P=0.000 2);100 μmol/L 時，是未選擇細胞的 32.90、12.63、12.26、3.70、2.56、13.67 倍(P ＜ 0.000 1)。而BCNU 50 μmol/L的篩選濃度與25 μmol/L的相比較并無統計學意義(P=0.208 4)，與100 μmol/L的篩選濃度相比較也無統計學意義(P=0.205 1);BCNU 100 μmol/L的篩選濃度與25 μmol/L的相比較也無統計學意義(P=0.122 1)。提示BCNU 50 μmol/L可能是比較合適的篩選濃度。

圖3 不同濃度BG-BCNU選擇對MEL細胞中重組慢病毒拷貝數影響

2.4 重組慢病毒轉染MEL細胞后hFⅨ表達水平的測定 MEL細胞以MOI=10分別感染各包裝濃縮的重組慢病毒，經不同濃度BG-BCNU篩選14 d后，用5 mmol/L的HMBA誘導向紅細胞分化，每24 h用ELISA方法檢測hFⅨ在紅細胞分化期間的表達水平，共檢測8 d，結果如圖4。未經BG-BCNU選擇的(以下簡稱未選擇)分別感染RT9、RT10、RS9、RT9-HS4(－)、RT9-IVS2(－)和RT9-E(－)的 MEL細胞經HMBA誘導8 d，hFⅨ的表達水平分別為4.31、7.20、6.46、35.58、3.80、0 ng/(ml·106cells);用 50 μmol/L BG-25 μmol/L BCNU 選擇后，經 HMBA誘導，各重組慢病毒在第8天hFⅨ的表達水平分別為83.48、99.17、124.78、99.28、38.36、36.54 ng/(ml·106cells)，是未選擇的 MEL細胞經 HMBA誘導8 d 的 19.37、13.77、19.32、2.79、10.09、36.54倍(P=0.003 2)。用 50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU選擇后，經HMBA誘導，各重組慢病毒在第8天hFⅨ的表達水平分別是為175.27、270.16、228.12、140.32、149.46、123.24 ng/(ml·106cells)，是未選擇誘導第 8 天的 40.67、37.52、35.32、3.94、39.33、123.24 倍(P=0.001 0);分別是 50 μmol/L BG-25 μmol/L BCNU選擇、HMBA誘導第8天hFⅨ表達水平的2.10、2.72、1.83、1.41、3.90、3.37 倍(P=0.002 1)。用50 μmol/L BG-100 μmol/L BCNU 選擇后，經 HMBA誘導，各重組慢病毒在第8天hFⅨ的表達水平分別為 199.93、286.63、205.75、162.71、142.58、150.14 ng/(ml·106cells)，均值達到生理水平的3.8%(191 ng/ml)，是未選擇誘導第 8天的 46.39、39.81、31.85、4.57、37.52、150.14 倍(P=0.029 3);分別是 50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU 選擇、HMBA 誘導第8天 hFⅨ表達水平的 1.14、1.06、0.90、1.16、0.95、1.22 倍(P=0.054 0)。提示 50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU選擇已能夠篩選富集足夠的陽性細胞用于后續的HMBA誘導和hFⅨ表達檢測。

圖4 不同濃度BG-BCNU選擇對誘導MEL細胞中hFIX表達水平的影響

2.5 各重組慢病毒載體結構對hFⅨ表達濃度的影響 在HMBA誘導的第0天，將50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU選擇的各重組慢病毒感染的MEL細胞用多重TaqMan PCR檢測重組VCN，將滴度HMBA誘導第8天的各重組慢病毒表達的hFⅨ換算成單病毒拷貝的表達量，結果如圖5所示。

圖5 50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU選擇后誘導MEL細胞，各重組慢病毒單拷貝表達的hFⅨ水平

慢病毒轉移載體RT10調控結構完整，單拷貝病毒在誘導第8天MEL細胞中表達的hFⅨ水平是LCR中缺失HS1和HS4的RT9-HS4(－)的2.08倍(P=0.003 7);RS9為縮短的啟動子，但表達的hFⅨ水平明顯提高，是RT9-HS4(－)的1.73倍(P=0.022 1);RT9表達的hFⅨ水平是RT9-HS4(－)的1.36倍(P=0.185 5);RT9-IVS2(－)表達的hFⅨ水平為RT9-HS4(－)的1.09倍(P=0.263 9);RT9-E(－)表達的hFⅨ水平為 RT9-HS4(－)的 1.03倍(P=0.204 8)。RT9、RT9-HS4(－)、RT9-IVS2(－)和RT9-E(－)4組重組慢病毒在誘導的MEL細胞中hFⅨ的表達水平兩兩之間差異均無統計學意義(P=0.152 7)。提示在刪除LCR中的HS1的基礎上再刪除HS4或IVS2或E，不再降低目的基因的表達。

3 討論

紅細胞(red blood cell，RBC)是一種重要的輸血產品(transfusion product，TP)，其來源主要有成人血液、干細胞(包括胚胎干細胞和誘導性多能干細胞)和重編程體細胞。RBC除了行使輸氧的生理功能外，近年來以之作為生物活性物質的生物相容性載體廣泛應用于抗體識別、藥物發現和藥物輸送等方面[11]。其主要是因為[12]:①RBC 可被完全生物降解而不產生毒性產物，尤其是使用自體RBC時表現出更高的生物相容性;②RBC很容易通過藥物誘導的細胞內吞作用、電穿孔、低滲方法、蛋白質轉導結構域(protein transduction domain，PTD)[13]或慢病毒轉染HSC等幾種技術處理來封裝不同的分子，而RBC的形態學、免疫學和生化性質不受影響;③可利用RBC較大的體積來封裝藥物;④RBC可保護封裝的物質不至于過早失活、降解，保護機體不受藥物的毒性影響;⑤與其他合成的載體相比，RBC在循環系統中的壽命較長;⑥由于存在幾種酶活性，RBC可以作為活性運載蛋白(生物反應器)，將選定的前體藥物轉換成可擴散的活性藥物。本研究在生物安全實驗室按生物安全操作規程完成全部實驗[14]，用紅細胞特異性重組慢病毒感染小鼠MEL細胞，經篩選、誘導后，在分化的終端紅細胞中檢測到了hFⅨ的表達。

MGMT的基因產物O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉移酶(O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase，AGT)可修復甲基亞硝脲等烷化劑造成的DNA烷化損傷。化療藥物1，3-二(2-氯乙基)-1-亞硝基脲，別名為雙氯乙亞硝脲，通用名為卡莫司汀，具有強烈的干細胞毒性。BG可使內源性AGT失活，提高對烷化劑的敏感性。體外實驗表明用慢病毒將MGMT突變體(G156A或P140K)導入造血祖細胞能夠產生更強的抗BG-BCNU聯合處理的效應[15]。本研究結果提示，用 50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU 可有效篩選富集攜帶MGMT基因的重組慢病毒感染的MEL陽性細胞。

血紅蛋白是由珠蛋白和血紅素組成的結合蛋白，人類珠蛋白基因包括類α-珠蛋白基因(α-like globin gene)和類β-珠蛋白基因(β-like globin gene)兩類。人類β-珠蛋白基因座由多個基因成簇排列，具有紅系組織和不同發育時相的特異性。β-珠蛋白基因的表達調控，不僅需要近側順式元件(β-啟動子、β-內含子及3'端增強子等)的參與，還需要LCR的作用。β-珠蛋白啟動子全長約2.1 kb，各種縮短的 β-珠蛋白啟動子如 110 bp、130 bp、266 bp、280 bp、333 bp、373 bp、615 bp、1.6 kb 等均有不同程度的轉錄調節活性[16]。β-珠蛋白有2個內含子，其中第2個內含子(intervening sequence 2，IVS2)，約476 bp，含有AT富含區(AT-rich region，ATR)和內含子增強子活性[17]。LCR由5個紅系特異和發育穩定的DNaseⅠ高敏位點組成，約21.5 kb，其主要的功能是激活β-珠蛋白基因簇，限制珠蛋白基因僅在紅系細胞中表達，可遠距離調控基因轉錄，確保受調控基因在發育或分化過程中以一定的時序和模式正確表達，是珠蛋白基因表達的重要調控元件[18]。LCR中HS2的增強子活性最強，HS3的染色質開放活性最強[19]，HS4也具有增強子活性;HS5具有絕緣子作用，可以有效阻止紅細胞中β-珠蛋白基因座周圍的異染色質區域的延伸;HS1的功能尚待確定。

本研究用β-珠蛋白的基因調控元件控制hFⅨ在藥物篩選后誘導的MEL細胞向紅系分化過程中表達，結果提示 RT9、RT10、RS9、RT9-HS4(－)、RT9-IVS2(－)和RT9-E(－)各重組慢病毒感染組在用 50 μmol/L BG-100 μmol/L BCNU 化療藥物選擇后，經HMBA誘導第8天在106個MEL細胞中hFIX的表達量分別達到其生理水平(5 000 ng/ml)的 4%(199.93 ng/ml)、5.7%(286.63 ng/ml)、4.1%(205.75 ng/ml)、3.2%(162.71 ng/ml)、2.8%(142.58 ng/ml)和 3%(150.14 ng/ml)，其均值達到3.8%(191 ng/ml)。提示RT9中刪除HS1，或在刪除HS1的同時縮短β-珠蛋白啟動子得到的RS9，以及在刪除HS1的同時刪除HS4或IVS2或E分別得到的RT9-HS4(－)、RT9-IVS2(－)和RT9-E(－)均可以在細胞水平實現hFⅨ的溫和提高。這些效應在動物體內是否一致還有待后續進一步實驗。本研究得到的紅細胞特異性重組慢病毒為后續動物實驗靶向基因治療奠定了基礎。

[1]Franchini M，Frattini F，Crestani S，et al.Haemophilia B:current pharmacotherapy and future directions[J].Expert Opin Pharmacother，2012，13(14):2053-2063.

[2]Petrus I，Chuah M，VandenDriessche T.Gene therapy strategies for hemophilia:benefits versus risks[J].J Gene Med，2010，12(10):797-809.

[3]Chang AH，Stephan MT，Sadelain M.Stem cell-derived erythroid cells mediate long-term systemic protein delivery[J].Nat Biotechnol，2006，24(8):1017-1021.

[4]Hu B，Tai A，Wang P.Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases[J].Immunol Rev，2011，239(1):45-61.

[5]Estefanía MM，Ganier O，Hernández P，et al.DNA replication fading as proliferating cells advance in their commitment to terminal differentiation[J].Sci Rep，2012，2:279.

[6]Melloni E，Pontremoli S，Michetti M，et al.Protein kinase C activity and hexamethylenebisacetamide-induced erythroleukemia cell differentiation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84(15):5282-5286.

[7]Demaison C，Parsley K，Brouns G，et al.High-level transduction and gene expression in hematopoietic repopulating cells using a human immunodeficiency[correction of imunodeficiency]virus type 1-based lentiviral vector containing an internal spleen focus forming virus promoter[J].Hum Gene Ther，2002，13(7):803-813.

[8]Chang AH，Stephan MT，Lisowski L，et al.Erythroid-specific human factorⅨdelivery from in vivo selected hematopoietic stem cells following nonmyeloablative conditioning in hemophilia B mice[J].Mol Ther，2008，16(10):1745-1752.

[9]Pan X，Tamilselvam B，Hansen EJ，et al.Modulation of iron homeostasis in macrophages by bacterial intracellular pathogens[J].BMC Microbiol，2010，10:64.

[10]Chang AH，Sadelain M.The genetic engineering of hematopoietic stem cells:the rise of lentiviral vectors，the conundrum of the ltr，and the promise of lineage-restricted vectors[J].Mol Ther，2007，15(3):445-456.

[11]Migliaccio AR，Whitsett C，Papayannopoulou T，et al.The potential of stem cells as an in vitro source of red blood cells for transfusion[J].Cell Stem Cell，2012，10(2):115-119.

[12]Biagiotti S，Paoletti MF，Fraternale A，et al.Drug delivery by red blood cells[J].IUBMB Life，2011，63(8):621-631.

[13]Kwon YM，Chung HS，Moon C，et al.L-Asparaginase encapsulated intact erythrocytes for treatment of acute lymphoblastic leukemia(ALL)[J].J Control Release，2009，139(3):182-189.

[14]Pan X.Isolator system for laboratory infectious animals[M]//Priti Kumar Roy.Insight and control of infectious disease in global scenario.Croatia:In Tech Press，2012:61-78.

[15]Zielske SP，Reese JS，Lingas KT，et al.In vivo selection of MGMT(P140K)lentivirus-transduced human NOD/SCID repopulating cells without pretransplant irradiation conditioning[J].J Clin Invest，2003，112(10):1561-1570.

[16]Hanawa H，Hargrove PW，Kepes S，et al.Extended betaglobin locus control region elements promote consistent therapeutic expression of a gamma-globin lentiviral vector in murine beta-thalassemia[J].Blood，2004，104(8):2281-2290.

[17]Buzina A，Lo MY，Moffett A，et al.Beta-globin LCR and intron elements cooperate and direct spatial reorganization for gene therapy[J].PLoS Genet，2008，4(4):e1000051.

[18]Peterson KR，Fedosyuk H，Harju-Baker S.LCR 5'hypersensitive site specificity for globin gene activation within the active chromatin hub[J].Nucleic Acids Res，2012，40(22):11256-11269.

[19]Patrinos GP，de Krom M，de Boer E，et al.Multiple interactions between regulatory regions are required to stabilize an active chromatin hub[J].Genes Dev，2004，18(12):1495-1509.