尿液小分子物質檢測及其應用前景

陳逸南，于穎彥

當前，在疾病檢查中，血尿便檢查是簡便而重要的手段之一。除此之外，再視患者病情而增加必要的內鏡、X線檢查等。但實踐中人們普遍感到，傳統(tǒng)的血尿便檢測靈敏度和特異度尚不高，難以滿足臨床需求。而內鏡、X線等檢查又存在操作復雜、對受檢者影響較大等而難以作為人群普查手段。多年來，研究人員一直探尋一種簡便易行、創(chuàng)傷性小且適合于疾病檢查的新方法。尿液是目前最方便獲得的生物樣本，其排泄物的變化不僅可以反映泌尿系統(tǒng)自身健康狀況，還可以反映全身的代謝狀況，圍繞尿液生物標志物研究已有不少報道[1-8]。由于尿液中小分子含量極低，常規(guī)檢測方法不易檢測，故在尿液生物標志物研究中，檢測方法的選擇與建立就顯得格外重要。

1 間接競爭酶聯(lián)免疫法

20世紀70年代建立的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)可以檢測體液樣本中的生物抗原。其基本原理是:將抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性;將抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，同時要保留其免疫活性和酶活性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，通過洗滌去除固相載體上其他物質，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的含量成比例。加入酶反應底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質含量相關，根據顏色反應深淺進行定性與定量分析。在酶催化反應中可放大反應效果，從而實現提高敏感度目的。ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，加之電腦化程度極高的ELISA檢測儀的應用，該法已經成為應用最廣泛的檢測方法之一。ELISA技術主要有直接法、間接法、競爭法等。小分子抗原或半抗原因缺乏可做夾心法的2個以上抗原表位而不能用雙抗體夾心法測定，需要采用競爭法檢測。競爭ELISA法又分為直接競爭ELISA和間接競爭ELISA，以間接競爭ELISA的靈敏度較高。其原理是標本中的抗原和固相抗原競爭抗體，前者結合力強而優(yōu)先與抗體結合反應，剩余抗體與固相抗原反應，故固相吸附的抗體與樣本中的抗原濃度成反比;之后在板孔中加入酶標二抗，標本中的抗原含量越多，結合在固相上的酶標二抗愈少，最后的顯色也愈淺(圖1)。在固相包被抗原的板孔里分別加入待測抗原和特異性抗體，溫育反應后通過洗板除去待測抗原、抗體復合物;而后在固相結合的抗體中加入酶標二抗，溫育反應后洗板去除多余二抗，再加入底物顯色，其顏色深度和待測樣品濃度呈反比。對小分子激素、化合物和藥物等的ELISA多采用此方法[9-14]。尿液中的小分子有機物抗原性弱，缺乏2個以上的抗原表位，故也應當選用間接競爭法檢測。根據以往報道，間接競爭法的檢測靈敏度可達到納克(ng)水平，且成本較低，適合大樣本檢測，具有廣泛的應用前景。

圖1 間接競爭ELISA

2 實時定量免疫聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)

免疫PCR技術是Sano等[15]建立的一種超高靈敏度的檢測方法，該方法綜合了固相免疫反應和PCR兩者的特點，在保證免疫測定特異性的同時又具有極高的靈敏度。免疫PCR的基本原理和常規(guī)標記免疫技術相似，只是標記抗原或抗體的標記物是DNA。若待測樣品為人類樣本，作為標記物的DNA最好來自細菌或噬菌體。在固相免疫結合反應步驟完成后再采用PCR對標記的DNA分子進行擴增，最后通過檢測DNA擴增產物來實現對抗原或抗體的定性或定量。該方法正在不斷改進與完善當中。在免疫PCR檢測中，固相包被的抗原與生物素化抗體結合后，洗去多余抗體再加入親和素后洗板;然后，加入生物素化的DNA，充分反應后洗板;最后進行PCR反應，因為PCR有很強的放大能力，可以定量檢測DNA的拷貝數(圖2)。該方法的敏感性和特異性遠遠高于ELISA。在包被待測抗原后，加入生物素化特異性抗體，溫育后洗去多余生物素化抗體;隨后加入親和素，溫育反應后洗去多余親和素;再加入生物素化DNA反應，洗板去除多余生物素化DNA后，用實時定量免疫PCR擴增生物素化DNA，從而實現對待測小分子的定量。

圖2 免疫PCR方法

2.1 抗原、抗體反應系統(tǒng) 免疫PCR中的免疫反應和普通的ELISA類似，被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相載體，而固相載體在免疫反應方面要求對抗原包被均勻，結合穩(wěn)定。PCR反應要求固相載體導熱性能好，耐高溫，液面小且不易揮發(fā)。而抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和素再結合DNA。Sano等最早采用的是直接利用DNA-抗體復合物和固相抗原結合法，但直接包被待檢抗原不適用于臨床標本和難以吸附固相抗原的檢測。隨后陸續(xù)出現了夾心免疫定量 PCR法[16-19](圖3)。其原理和普通夾心ELISA類似，特異性抗體吸附至固相載體上，先后加入樣本、生物素化抗體、親和素、生物素化DNA，最終固定于固相載體上的生物素化DNA與目標物質的含量相關，通過實時熒光定量PCR可以檢測樣本中的目標抗原。

圖3 夾心免疫定量PCR

2.2 連接系統(tǒng) 連接系統(tǒng)是指連接抗原-抗體反應系統(tǒng)與DNA分子之間的連接分子或復合物，是免疫PCR技術的關鍵環(huán)節(jié)。Sano等使用的是重組葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)-鏈親和素嵌合蛋白。此嵌合蛋白的鏈親和素部分能識別DNA上的生物素，SPA部分可以被特異性抗體的Fc段所識別，IgG便與生物素化的DNA連接成復合物。然而，SPA不但可以結合特異抗體的IgG，還可以與樣品中吸附于固相載體的無關IgG結合，易導致本底高和特異性差。Ruzicka等[20]用商業(yè)化的親和素建立了一種免疫PCR。其基本方法是先將親和素和生物素化的DNA預結合成復合物，然后與結合固相的生物素化抗體反應。由于1個親和素可以結合4個生物素分子，因此在預結合時如果生物素化的DNA分子過多，將親和素完全飽和，親和素就再無結合生物素化抗體的能力了。只有部分結合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用。因此，每次制備的連接分子結合能力均有差異，導致可重復性較差。Zhou等[21]將連接分子改進成鏈親和素，生物素和鏈親和素都已商品化。

2.3 標記分子DNA和PCR反應系統(tǒng) 免疫PCR中的DNA是作為標記分子，用DNA聚合酶將結合于固相載體上的DNA進行擴增，由此定量檢測抗原。免疫PCR中的DNA分子可以是任何DNA，但要確保DNA的純度和較好的均質性，且引物容易設計、易于擴增和退火溫度適中。此外，要與待檢樣品中可能存在的DNA非同源性。在分析人類生物樣本時一般選用質粒或細菌DNA。DNA的生物素化是用生物素標記的脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate，dATP)或脫氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)通過DNA聚合酶標記在DNA分子上。生物素化的DNA用量需預先選定，過多易出現非特異結合而引起本底過高，過低將導致敏感性低和出現不同濃度抗原得出同樣結果的飽和現象。

2.4 檢測系統(tǒng) 由于免疫PCR是檢測擴增的DNA拷貝數，故可以實現定量檢測目的，可以借助于凝膠電泳、微孔板技術、實時熒光檢測等。電泳法雖然復雜耗時，但仍有一些報道[15，20，22-23]。微孔板技術包括PCR-ELISA[24]，可以實現對大樣本的平行檢測。實時熒光檢測技術在樣本PCR的過程中直接收集熒光數字信號，成本較低且減少了樣品的污染，是對PCR檢測技術的發(fā)展。在實時熒光定量PCR反應中引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化。McKie等[25]首次將熒光定量PCR技術和免疫PCR技術結合起來對腮腺炎病毒特異性抗體進行了檢測。他們將指示分子通過化學交聯(lián)劑與抗體交聯(lián)，利用熒光定量PCR儀檢測指示分子，通過PCR測定出指示分子的量與檢測標本中特異性抗體的水平呈正相關來推算樣品中特異性抗體的含量。

隨著靈敏度和再現性問題的解決，實時熒光定量免疫PCR技術得到了廣泛的應用。在醫(yī)學領域，有研究者利用該技術對血清中的病毒、細菌的抗原和抗體進行檢測[17，26-29]，也有學者將該法應用于腫瘤標志物檢測[30-31]，其檢測靈敏度達到皮克(pg)水平。

3 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀技術

代謝物組學是后基因時代的一門學科，由英國倫敦大學帝國學院的Nicholson教授于1999年提出，旨在對生物系統(tǒng)的小分子混合物進行分析，并對生物標本代謝物含量變化進行檢測。其中，磁共振技術和質譜儀是用于代謝物檢測的最常用技術。以質譜為基礎的技術包括氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)、氣相色譜-質譜/質譜聯(lián)用儀(gas chromatography tandem mass spectrometer，GC-MS/MS)、液相色譜-質譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、液相色譜-質譜/質譜聯(lián)用儀(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)。而 GC-MS技術由于其高分辨率、高靈敏度、可重復性而被廣泛應用于代謝物組學研究中。近年來，人們逐漸把該技術引入尿液腫瘤標志物的研究，并在胃癌[7]、結腸癌[32]、膀胱癌[33]、肺癌[34]、腎癌[35]、前列腺癌[36]等疾病研究中取得了一系列發(fā)現。GC-MS技術在尿液檢測中的作用已經得到了人們的認可。

3.1 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀技術工作原理 氣相色譜法是利用不同物質在固定相和流動相分配系數的差別，使不同化合物從色譜柱流出的時間不同，以達到分離的目的。氣相色譜法提供保留時間和強度二維信息，得到的是二維譜圖。其最大特點在于高效的分離能力和高的靈敏度，因此是分離混合物的有效手段。

質譜法是利用帶電粒子在磁場或電場中的運動規(guī)律，按其質荷比實現分離分析，測定離子質量及其強度分布。主要特點是能給出化合物的分子量、元素組成、化學式及分子結構信息，具有定性專屬性強、靈敏度高、檢測快速的優(yōu)勢。

氣相色譜法定性依據是色譜峰的保留時間，定量依據則是色譜峰高或峰面積。然而不同物質總避免不了同一色譜柱上保留時間相同的可能性，而且保留值測定的重復性仍是氣相色譜法致力解決的一個問題。另一方面，質譜儀檢測法對樣品的檢測要求較高，樣品純度越高，雜質形成的本底對質譜圖產生的干擾越小，得到的質譜圖越容易解析。兩者的優(yōu)劣正好互補，氣相色譜對樣品高效的分離能力正好滿足質譜儀對樣品高純度的要求，而后者對純物質準確的定性能力也填補了氣相色譜無法定性的缺陷。樣品混合物經過適當的衍生化處理后進入GCMS，在高溫下、汽化后在離子源的作用下樣品分子轉化為離子，隨后進入色譜柱，經過分離后各組分依次進入質譜儀檢測(圖4)。汽化后的混合物在氣相色譜儀中分離，得到色譜圖;隨后，樣品離子進入質譜儀檢測，得到各物質質譜圖。

圖4 GC-MS工作原理

這樣，混合物經過GC-MS測定后，通過氣相色譜得到保留時間和強度信息，再從質譜儀得到質荷比和強度信息，從而實現三維信息的建立，保留時間和質譜圖的雙重定性，大大提高了定性的準確性，而后從質譜峰強度信息得到樣品的含量信息。

3.2 GC-MS的定性與定量 GC-MS的定性主要手段是譜庫檢索。通常GC-MS的數據系統(tǒng)軟件都配有不同的質譜數據庫和譜庫檢索程序，較通用的是國家標準與技術研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)檢索系統(tǒng)。該質譜數據庫收集的質譜圖用正常(70 eV)的電離方式，在一定條件下獲得純化合物的質譜圖以及化合物相關信息，該質譜圖又稱為“標準譜圖”。實際應用中，數據庫系統(tǒng)會將未知化合物和譜庫中標準譜圖逐一進行比較，然后按相似系數(又稱匹配率)由高到低順序排列。比較的方法有兩種，一種為“正檢索”，即未知譜圖和參考譜圖逐個峰比較，看譜庫中是否存在與未知譜相同的參考譜圖;反之，看參考譜中的各質量峰是否出現在未知譜中，稱為“逆檢索”。正檢索、逆檢索的匹配率最大值均為1 000，一般大于900則結果可靠性大，如小于600則可靠性較差(不同儀器有不同表示方法)。但實際上并不是匹配率高就能定性，因為“標準譜圖”是在特定條件下的純物質質譜圖，而每次檢測時GC-MS條件不同，所用儀器類型也不完全相同，得到的譜圖也會有所偏差。另一方面，異構體、同系物、結構相似化合物譜圖相近，檢索結果匹配率也相近，無法簡單的按匹配率高低來確定，此時則需要依賴保留時間來輔助。

GC-MS分析中，計算機將采集的質譜信號處理后以不同的譜圖形式再現，除了質譜圖外，還有總離子流色譜圖(total ion current，TIC)、質量色譜圖(mass chromatography，MC)等，是對幾個目標化合物的特征離子進行檢測，而不檢測不需要的質量離子。由圖5可見，MC圖明顯簡潔明了，不僅能排除基質和雜質峰的干擾，還極大地提高檢測靈敏度，該方法為目前GC-MS定量的首要方法。TIC圖相當于色譜圖(圖6)，顯示的是經色譜柱流出的所有組分的色譜峰。質量色譜圖是由TIC圖重新建立的特定質量離子強度隨掃描時間變化的離子流圖，其顯示為具有所選擇特征質量的那些組分的色譜峰(圖5)。由于一次進樣只能檢測選定的某幾個離子，其他離子都不檢測，因此其掃描靈敏度遠遠高于全掃描;另外，其色譜圖比TIC圖簡潔，消除了背景的干擾，因此GC-MS定量分析多采用質量色譜峰面積定量。GC-MS常用的定量方法和色譜一樣，有歸一化法、外標法、內標法等?，F代GC-MS的分離度和分析速度、靈敏度、專屬性和通用性，至今仍是其他聯(lián)用技術難以達到的。因此，只要待測成分適用于GC分離，GC-MS就成為聯(lián)用技術中首選的分析方法。

圖5 質量色譜圖(MC圖)

圖6 GC-MS總離子流色譜圖(TIC圖)

4 尿液標本的前處理

尿液中含有豐富的代謝產物，成分復雜，因此進行檢測時，需進行一定的前處理，以更好地適應檢測方法學要求。對于ELISA和實時定量免疫PCR而言，由于尿液中可能存在的蛋白、有機物與抗體的非特異性結合會對結果產生干擾，因此對收集的尿樣，應首先10 000 r/min×20 min離心后置于－80℃冰箱保存，必要時，可考慮再以截留相對分子質量為10×103的超濾離心管5 000 r/min×20 min離心去除樣品中其余的干擾組分。相對而言，GC-MS的前處理要求較高，只有當樣品能揮發(fā)且遇熱穩(wěn)定時才能直接進行GC-MS分析。而尿液中許多代謝物具有親水性化學基團，常規(guī)的GC-MS顯然不適于研究極性和親水性化合物。衍生化方法可以將難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定化合物通過化學反應轉變成易揮發(fā)和遇熱穩(wěn)定的化合物，然后再進行GC-MS分析。目前，常用的衍生化法中有硅烷化反應、?；磻?、烷基化反應、酯化反應等。其中，硅烷化是GC-MS分析中最廣泛使用的衍生化方法，但其不足之處在于衍生化需花費較多時間。Qiu等[37]最近建立了一種以氯甲酸乙酯(ethyl chloroformate，ECF)作為衍生試劑的衍生化方法，并在尿液、血液中取得成功。該方法能將尿液中的氨基酸、胺類、有機酸等物質迅速酯化，操作簡便，周期較短，穩(wěn)定性較高，適合尿液GC-MS樣品的衍生化要求。

5 尿液小分子物質檢測臨床應用前景

尿液中含有豐富的機體代謝產物，這些代謝產物以小分子化合物為主，尿液小分子化合物檢測與鑒定對技術的要求較高。前述幾種方法各有利弊，ELISA技術是目前應用最廣泛的檢測技術之一。該方法成熟而成本低，特別是對于大樣本的檢測具有明顯優(yōu)勢。但是如果選用ELISA法，則必須考慮無關蛋白與抗體的非特異性結合，可能出現假陽性或假陰性。免疫PCR技術因其特異性強、靈敏性高，更適合于極微量抗原、抗體的檢測，但存在操作步驟比ELISA技術繁瑣的缺陷，而且免疫PCR技術處于起步階段尚未標準化。GC-MS是一項較為成熟技術，在低含量物質檢測中靈敏度高且方法穩(wěn)定;其不足之處是設備昂貴，對操作人員的技術要求較高，且操作過程煩瑣，樣本前處理復雜，總體檢測耗時較長。對于臨床大樣本的檢測分析，GC-MS成本較高，作為臨床常規(guī)應用尚有困難。尿液小分子具有采集方便、無創(chuàng)等優(yōu)點，尿液小分子的檢測可以發(fā)現與疾病相關的生物標志物并進行分子診斷，實現分子醫(yī)學向臨床轉化[38]。綜上所述，目前GC-MS主要用于科學研究中樣品定量的金標準;ELISA技術仍然是臨床最常用的檢測方法，對于大樣本的檢測篩查仍然首選ELISA法，如能進一步提高ELISA法靈敏度和特異度，其可在在臨床中發(fā)揮更大作用;實時定量免疫PCR技術靈敏度高而具有較大的發(fā)展空間，如其儀器、試劑能進一步標準化、商品化，其前景將更加廣闊。

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