腫柄菊粗提物對線蟲毒殺活性的研究

張余杰，劉志華，張 亞，秦小萍，何金玲

（1.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明650201；2.河南省濮陽縣農業局，河南 濮陽457100；3.湖南農業大學生物安全科技學院，湖南 長沙410128）

腫柄菊（Tithonia diversifolia A.Gray），屬于菊科腫柄菊屬植物，又稱金光菊、樹菊，多年生半灌木狀草木植物，根系發達，莖粗壯，繁殖力強，能在各類土壤中生長[1］。原產地為墨西哥及中美洲地區，現大量分布于熱帶和亞熱帶，在東南亞、南非、太平洋的一些國家和地區成為入侵田間、路邊的雜草，逐漸擴散形成單一優勢種群[2］。目前，腫柄菊在我國廣東、廣西、福建、云南等省有逃逸種群分布，尤其是環境適宜的云南省，已經給該地區的農業生產帶來一定危害，同時對生物多樣性造成了威脅，是一種具有較大潛在危害性的外來植物[3］。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是近些年來廣泛應用于毒理學研究的經典模式動物[4，5］。秀麗隱桿線蟲繁殖速度快，在土壤和水中都能生存，十分有利于短期藥效試驗。

菊科植物化學成分的復雜性和多樣性均居植物界之首，潛在著大量的殺菌、殺蟲活性成分，具有極高的研究價值和廣闊的開發利用前景[6］。但國內外對腫柄菊的研究并不多，主要集中在除草和殺蟲活性研究、藥物開發、有機肥料的利用等方面。郝妮娜等[7］研究表明腫柄菊提取物對7種病原菌具有抑制作用。楊海艷等[8］報道了腫柄菊對蜈蚣蕨孢子萌發和假根生長的影響。王麗等[9］研究表明腫柄菊水提液對水田稗和玉米種子萌發具有顯著的抑制作用。Jama等[10］報道腫柄菊作為綠肥不僅可以豐富作物營養物質來源，而且可以降低土壤中某些物質對磷元素的吸附并增加土壤微生物的量。Basamba等[11］研究表明腫柄菊可以顯著提高貧瘠土壤的交換性鈣、鎂、鉀等營養成分。Herrera等[12］從腫柄菊中分離出4種倍半萜烯內酯類化合物。Macias等[13］對腫柄菊的研究為開發新作用靶點的除草劑和殺蟲劑提供了新思路。Adedire等[14］研究表明腫柄菊葉干粉乙醇提取物對四紋豆象有明顯的殺卵、抗成蟲羽化和殺蟲作用，具有開發為昆蟲殺蟲劑的潛力。周鴻等[15］報道了腫柄菊3種成分：圓葉腫柄菊素A、圓葉腫柄菊素C和3，5－二氧－咖啡酰奎尼酸，其中咖啡酰奎尼酸有一定的抗菌活性[16］。Bordoloi等[17］研究表明腫柄菊含有的青蒿酸、青蒿素等可開發為天然的植物生長調節物質，亦可以作為天然除草劑合成的模型物。

目前，有關腫柄菊提取物對線蟲的毒殺活性及其成分還缺乏研究，其毒殺線蟲的機制更是鮮有報道。作者在此考察腫柄菊的不同有機溶劑粗提物的毒殺線蟲活性（簡稱殺線活性），擬為研制高效低毒、綠色環保的新型殺線蟲農藥奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料

腫柄菊（Tithonia diversifolia）采集于云南昆明跑馬山區域。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）由云南農業大學植物保護學院農藥系提供。用貝曼氏漏斗法分離出一定數量的線蟲，采用離心機清洗純化（1500r·min－1，5min）3次，加入適量蒸餾水，配制成每毫升含秀麗隱桿線蟲約7條的懸液（混合蟲齡），封口膜密封，備用。

1.2 試劑與儀器

石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇均為化學純，丙酮為分析純，實驗用水為蒸餾水。

BCD－215YD型冰箱，青島海爾股份有限公司；SHB－Ⅲ型真空泵、HH－S型水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司；HS.Z68.10型蒸餾水器，北京中興偉業儀器有限公司；SW－CJ－1FD型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SZM系列體視顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；R205B型旋轉蒸發器，上海申生科技有限公司；FA2004型上皿電子天平，上海精科天平；8200H型超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；FZ102型微型植物粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；RXZ型智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；Finnpipette colour型單道移液器（20～200μL），芬蘭雷勃集團；TopPette型單道移液器（100～1000μL），大龍興創實驗儀器有限公司；YXQ.SG46.280型手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫用核子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗提物的制備

1.3.1.1 石油醚／乙酸乙酯粗提物的制備

將采集的腫柄菊枝葉在自然條件下晾1～2d，然后置于45℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，用微型粉碎機粉碎后過40目篩。稱取一定量粉末放入三角瓶中，加入石油醚／乙酸乙酯浸泡24h，然后置于超聲波清洗器中振蕩30min。最后用濾紙過濾，所得濾液用旋轉蒸發器減壓濃縮蒸干，即得到石油醚／乙酸乙酯粗提物，密封置于冰箱中冷藏，備用。

1.3.1.2 二氯甲烷粗提物的制備

將采集的腫柄菊枝葉在自然條件下晾1～2d，然后置于45℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，收集干枝葉600g，分裝于3個三角瓶中，然后加入適量二氯甲烷浸泡24h。所得浸泡液用濾紙過濾，濾液用旋轉蒸發器減壓濃縮蒸干。將所得黃色提取物重新溶解在甲醇－水（7∶3）中，室溫下過夜，棄沉淀，所得上清液再次用石油醚（沸點40～60℃）萃取，蒸干，即得到二氯甲烷粗提物，密封置于冰箱中冷藏，備用。

1.3.2 毒殺線蟲實驗

采用藥液浸漬法[18］。用分析天平準確稱取一定量的粗提物，先加入一定量的丙酮（體積分數不超過5%）溶解，再加入適量蒸餾水，分別配制成10mg·mL－1、20mg·mL－1、40mg·mL－1共3個質量濃度的藥液，封口膜封好，備用。取直徑6cm小玻璃培養皿若干，分別加入搖勻的線蟲懸液7mL，再加入3mL不同質量濃度的藥液，每個處理做4組平行實驗。以丙酮溶液（丙酮＋蒸餾水）作為對照，丙酮的濃度與藥液中的丙酮濃度相同。最后將培養皿置于5℃、RH60%黑暗的培養箱中培養，分別于24h、48h、72h用體視顯微鏡觀察3次，用針刺法確定線蟲死亡與否，記錄每次線蟲死亡的條數。

1.4 統計分析

各處理組的死亡率、校正死亡率按下式計算：

按文獻方法[19］將殺線活性分為五級：

“－”：表示校正死亡率≤10%，無殺線活性；

“＋”：表示校正死亡率為10%～30%，殺線活性弱；

“＋ ＋”：表示校正死亡率為30%～50%，殺線活性中等；

“＋ ＋ ＋”：表示校正死亡率為50%～80%，殺線活性較強；

“＋ ＋ ＋ ＋”：表示校正死亡率＞80%，殺線活性強。

2 結果與討論

2.1 腫柄菊不同粗提物的殺線活性（表1 ）

由表1 可知，乙酸乙酯和石油醚粗提物的殺線活性隨其濃度的增大逐漸提高，但二氯甲烷粗提物例外，其殺線活性在中等濃度時較高。濃度為10mg·mL－1時，3種粗提物均無殺線活性；濃度為20mg·mL－1時，殺線活性大小依次為二氯甲烷粗提物＞石油醚粗提物＞乙酸乙酯粗提物，二氯甲烷粗提物處理72h后，線蟲校正死亡率達到50.6%，而石油醚和乙酸乙酯粗提物處理72h后的線蟲校正死亡率分別為42.9%、33.3%；濃度為40mg·mL－1時，乙酸乙酯和石油醚粗提物處理48h后的殺線蟲效果已較好，處理72h后線蟲校正死亡率分別達到73.6%、70.8%，而二氯甲烷粗提物殺線活性較弱。總體而言，乙酸乙酯和石油醚粗提物的殺線活性較好。

表1 腫柄菊不同粗提物的殺線活性Tab.1 Poisonous activity on Caenorhabditis elegans of different Tithonia diversifolia crude extracts

2.2 討論

目前，化學藥劑仍是防治線蟲的主要手段，比較常用的殺線蟲劑為溴甲烷、克百威、噻唑磷等，存在持效長、污染嚴重等問題，與現代社會環保節約的發展理念相悖。隨著人類環保意識的加強，化學藥劑將會逐漸停止使用，研究、開發新型高效殺線蟲劑是線蟲防治發展的趨勢。20世紀80年代，許多國家開始了植物源殺線蟲劑的研究，其中美國、英國和印度對此方面研究較多，確定了很多植物活性成分的殺線活性，取得了較大的進展[20，21］。截止2009年，已經報道具有殺線活性的植物約有100多種、40多科，其中具有殺線活性的天然化合物也達到10多類100多個[22，23］。

對腫柄菊3種不同有機溶劑粗提物的殺線活性分析表明，乙酸乙酯和石油醚粗提物殺線蟲效果較好，在生物防治線蟲方面具有廣闊的開發前景。本研究結果與龍鼎新等[24］開發的化學藥劑對松材線蟲的活性結果相比，存在一定差距，主要原因可能是：（1）本研究所使用的粗提物中有效殺線蟲活性成分的含量不高，分離純化后其殺線蟲效果可能會大大提高；（2）秀麗隱桿線蟲和松材線蟲雖然同屬于線形動物門線蟲綱，但在生理特性、生活習性等方面存在一些差異，一定程度上影響了實驗結果；（3）實驗過程中人為因素的影響。但本研究結果與禁用的劇毒農藥甲胺磷相比，殺線蟲效果差異較小。翁群芳等[25］的研究也表明腫柄菊粗提物對松材線蟲的毒殺效果較好。

本研究只是對腫柄菊地上部分的粗提物進行了殺線活性研究，沒有進行盆栽試驗，未能深入研究有效殺線蟲活性成分在枝葉中含量的高低，也未對粗提物中有效成分進行分離和鑒定，這些將是下一步研究的重點和方向。

3 結論

腫柄菊不同溶劑的粗提物具有較好的毒殺線蟲活性，當濃度為10mg·mL－1時，石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷粗提物24～72h內對線蟲的毒殺效果較弱；當濃度為20mg·mL－1時，二氯甲烷粗提物毒殺線蟲活性最好，處理72h的線蟲校正死亡率可達50.6%，乙酸乙酯粗提物和石油醚粗提物毒殺線蟲活性均較弱；當濃度為40mg·mL－1時，毒殺線蟲活性大小依次是乙酸乙酯粗提物＞石油醚粗提物＞二氯甲烷粗提物，其中乙酸乙酯粗提物處理72h的線蟲校正死亡率達73.6%。未來應結合多種技術手段，將不同溶劑粗提物中的活性物質進行分離、純化，有望開發出高效低毒、綠色環保的新型殺線蟲農藥。

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