香菇六糖的脫保護反應研究及表征

樊 榕，殷慧清，尹文娟，徐芳芳

（常州蘭陵制藥有限公司，江蘇 常州213018）

許多菌類多糖，如 Lentinan（香菇多糖）[1］、Grifolan（灰樹花多糖）[2］、Schizophyllan（裂褶菌多糖）[3］以及Pochyman（茯苓聚糖）[4］等都具有抗腫瘤活性。研究表明，多糖的抗腫瘤活性主要是通過人體的免疫系統起作用而不是直接抑制腫瘤細胞的生長[5］，所以多糖抗腫瘤藥物對人體的毒副作用要比其它抗腫瘤藥物小很多。已有香菇多糖提取物被作為輔助藥物用于臨床治療癌癥[6］。然而像大多數天然提取的多糖一樣，香菇多糖不能獲得很高的純度，而且分子量常常不確定，因而大大影響了它在臨床上的應用。中國科學院生態環境研究中心的寧君首次合成了一系列香菇多糖的核心寡糖片段及其類似物，這些寡糖片段與天然來源的香菇多糖相比，活性相當甚至更好[7］。

香菇六糖的合成通常涉及上保護基和脫保護基，其中脫保護反應是整個合成過程中的關鍵步驟。寧君等[8］報道的脫保護過程收率較低，導致總收率也大大降低。為了提高收率，作者在此先按專利方法合成香菇六糖的乙酰化化合物，再對脫保護基工藝進行改進，并對所獲得的香菇六糖進行了1HNMR、13CNMR、MS表征。脫保護反應過程見圖1。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為分析純。

SGW X－4型顯微熔點儀（溫度計未經校正）；Bruker AM 300MHz型核磁共振儀（D2O為溶劑）；ZAB－2F型質譜儀（英國VG公司）；CARBOSep型糖柱；RI2001型示差折光檢測器。

圖1 香菇六糖的脫保護反應Fig.1 Deprotection reaction of lentinan

1.2 香菇六糖的脫保護反應

將得到的乙酰化香菇六糖盡量抽干；取25g（0.0095mol），加入100mL二氯甲烷使溶解，再加入500mL通有飽和氨氣的甲醇溶液（氨濃度≥6mol·L－1），搖勻，密封，在約25℃下靜置反應7d；蒸餾至干，加入500mL通有飽和氨氣的甲醇溶液，密封，靜置7d；將結晶產物過濾、抽干；加入一定量的乙酸乙酯，攪拌過夜；次日再過濾、抽干，將濾液蒸餾至溶液剩余一半；加入約200mL二氯甲烷使之結晶，過濾，用二氯甲烷洗滌后置于圓底燒瓶中；真空抽干，得約1g產品，加入5mL乙醇，60℃攪拌2h，抽濾，干燥，得淡黃色固體香菇六糖9.1g（0.0092mol）。

1.3 含量測定

采用HPLC法測定香菇六糖含量。

色譜條件：用糖柱 CARBOSep COREGEL－87P（TRANSGENOMIC，No：11720901，8μm，7.8mm×300mm）為填充柱；流動相為去離子水；柱溫80℃；示差折光檢測器溫度40℃；流速0.5mL·min－1。理論塔板數按香菇六糖峰計算應不低于500，三者分離度均應符合規定。

2 結果與討論

2.1 結構表征

香菇六糖，收率96.8%，熔點180～184 ℃；1HNMR，δ：5.32（d，1H），4.71（2H，與水峰相重疊），4.50（d，2H），4.22～4.11（m，4H），3.99～3.37（m，33H）；13CNMR，δ：105.42，105.38，105.34，101.72，87.86，87.65，85.39，84.49，78.58，78.50，78.47，78.26，78.21，78.13，76.47，76.05，75.75，75.71，74.84，73.76，73.41，72.46，72.23，71.57，71.01，70.89，70.38，64.32，63.36，63.16；MS：990.4（M峰），991.4（M＋1峰），1012.4（M＋Na峰），1013.4（M＋1＋Na峰），1014.4（M＋2＋Na峰）。

2.2 樣品含量測定

取獲得的香菇六糖適量，精密稱定，加水定量稀釋成1mg·mL－1的香菇六糖溶液，作為供試品溶液。精密量取10μL供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取香菇六糖對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成1mg·mL－1的溶液，搖勻，同法測定。按外標法以峰面積計算，測得含量為99.89%。

2.3 討論

（1）在脫保護反應中，要求乙酰化香菇六糖的純度較高，在TLC薄層層析時不得有雜質點出現，否則會影響最終收率。

（2）香菇六糖極易潮解。首次過濾出來的產物由于純度不高，不易潮解；而再次加入二氯甲烷進行重結晶所獲得的產物，必須快速抽干，否則易潮解。對二次過濾產物需要加入無水乙醇（每克產品加入無水乙醇5g）進行洗滌。

（3）測定含量時，由于香菇六糖的特殊性，需要使用糖柱為填充柱。若使用氨基色譜柱，將會在樣品主峰出峰后出現倒峰，對測定有干擾；若選用蒸發散射檢測器，無論以何種比例的流動相，均會出現裂縫。柱溫對香菇六糖的含量測定同樣存在影響，若使用60℃柱溫，主峰將會變成2個峰，并且噪音較大，結果不理想。

3 結論

對香菇六糖的脫保護反應進行工藝改進，使香菇六糖收率提高至96.8%，含量達到99.89%，并對所獲得的香菇六糖進行了1HNMR、13CNMR、MS表征。為香菇六糖的進一步研究奠定了基礎。

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