酸奶中桿菌和球菌的快速分離及發酵劑的制備

付 鴻，李靖靖，岳 春

（1.中州大學化工食品學院，河南 鄭州450044；2.南陽理工學院生物與化學工程學院，河南 南陽473004）

近年來，隨著人民生活水平的提高和健康意識的增強，我國發酵酸乳制品工業迅猛發展[1］。酸奶以其獨特的風味和特有的保健功能越來越受到人們的喜愛，其產量正以每年25%的速度遞增[2］，這對酸奶發酵劑的品質、特性、種類提出了新的要求。目前，我國酸奶發酵劑的制備大多停留在傳統人工型發酵劑水平上，一般需要配備專門菌種室、專業人員、專用設備，存在工序多、周期長、菌種容易污染和退化等缺點，導致酸奶質量不穩定，影響了企業的信譽和酸奶產業的發展[3］。

要獲得良好的酸乳制品，其發酵菌種中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例一般應為（1～2）∶1，但由于兩者的生長要求和耐酸能力不同，在繼代培養后兩者的比例會發生變化，若干代后的菌種便不能用于生產，有些甚至產生雜菌，給酸奶的風味帶來很大的影響。為此，作者利用這兩種菌不同的生長特性，先將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌分離，再按（1～2）∶1的比例混合培養后用于制備酸奶發酵劑，可有效地解決這一問題。

1 實驗

1.1 菌種、試劑與儀器

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌（生產發酵劑），由三色鴿乳業提供。

鹽酸、NaOH、葡萄糖、酵母膏、溴甲酚綠、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，均為分析純；脫脂乳粉、乳粉水解液，均為食品級。

YQX型厭氧培養箱、恒溫培養箱、超凈工作臺、高壓滅菌鍋等。

1.2 方法

實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimental process

1.2.1 乳酸菌混合菌種的活化

按1∶7（質量體積比）的比例將脫脂乳粉和水配成復原牛奶600mL，加入15g蔗糖，充分混合，于80～85℃滅菌10～15min，然后冷卻至40℃，在無菌操作下，等量裝入3個250mL的錐形瓶中，接入5%的乳酸菌混合菌種，置于42℃恒溫培養箱中培養4h，取出，連續活化兩代后備用。

1.2.2 乳酸菌混合菌的分離[4，5］

乳酸菌混合菌分離培養基：牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，蕃茄汁20%，吐溫－80 0.05%，CaCO32g，瓊脂2g，蒸餾水100mL，pH 值6.5，于121℃滅菌20min，備用。

取活化乳酸菌混合菌種1mL加入到9mL無菌水中，依次用10倍法稀釋至10－6；取各個稀釋度菌液1mL與已滅菌的培養基制成混合平板；將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保溫42℃，培養2～3d，挑選單個菌落，接種于液體培養基中，用無菌玻璃刮鏟依次涂布，或直接用接種環沾取原液，平板劃線分離，于40℃培養48h，如出現圓形稍扁平的淡黃色菌落且其周圍培養基變為黃色者，可初步定為乳酸菌。反復進行3～5次純化，通過檢查繼代培養中長出的所有菌落形態是否一致判斷乳酸菌純度，待確認為純種后，再進行鑒定、保存。

1.2.3 保加利亞乳桿菌的分離與鑒定

將BCP培養基的pH值用1%的鹽酸調至5.0，于121℃滅菌20min；無菌條件下倒平板凝固后，挑乳酸菌混合菌種劃平板，將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保溫42℃，培養48h，反復進行3～5次純化，通過檢查繼代培養中長出的所有菌落形態是否一致判斷保加利亞乳桿菌純度，待確認為純種后，再進行鑒定。

1.2.4 嗜熱鏈球菌的分離與鑒定

將BCP培養基的pH值用1%的NaOH調至9.0，于121℃滅菌20min，無菌條件下倒平板凝固后，挑乳酸菌混合菌種劃平板，將制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保溫42℃，培養48h，反復進行3～5次純化，通過檢查繼代培養中長出的所有菌落形態是否一致判斷嗜熱鏈球菌純度，待確認為純種后，再進行鑒定。

1.2.5 酸奶混合菌種的制備

1.2.5.1 乳酸菌種的活化與計數

活化培養基：脫脂乳粉13%，葡萄糖2%，乳粉水解液4%，酵母浸膏0.25%，溶劑為0.025mol·L－1NaH2PO4－Na2HPO4緩沖溶液（pH＝6.8）。

選擇性培養基主要用于單菌分離，并非最適合生長培基。分別將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在活化培養基上于42℃活化6h，采用菌落計數法計算酸乳中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數量。

1.2.5.2 液體菌種的混合

取1mL桿菌活化液和12.5mL球菌活化液，混合，作為酸奶混合菌種。

1.2.6 酸奶發酵劑的制備

1.2.6.1 種子發酵劑的制備

培養基：5mL 5%的石蕊液加入100mL脫脂乳（脫脂乳粉與5%蔗糖水以1∶10比例配制）移至250mL的三角瓶中。于121℃、0.15MPa滅菌20min。

接種：在石蕊牛乳上接1mL酸奶混合菌種于42℃培養箱培養至液面呈紅色。

1.2.6.2 母發酵劑的制備

在250mL三角瓶中加入150mL脫脂乳（按1∶7的比例將脫脂乳粉和水配成復原牛奶，然后加入4g蔗糖）于121℃、0.15MPa滅菌20min，冷卻后用已滅菌的吸管吸取1mL凝塊，放入三角燒瓶中，攪拌后于42℃培養至酸度達0.8%～1.0%。

1.2.6.3 工作發酵劑的制備

將新鮮牛乳于90～95℃ 巴氏殺菌30～60min，冷卻至42～45℃，無菌條件下接種2%母發酵劑，培養4～6h，冷卻后熟即得菌種。

將新鮮牛奶過濾，于95℃巴氏殺菌10min，冷卻至45℃，接種3%的上一步菌種，發酵4h，后熟12h，即得工作發酵劑。經測定，其活力為0.85%。

1.3 分析檢測

1.3.1 活力測定[6］

活力檢查：使用前在化驗室對發酵劑的活力進行檢查，依據發酵劑的酸生成狀況或色素還原情況進行判斷（好的酸乳發酵劑活力一般在0.8%以上）。

活力測定：在滅菌冷卻后的脫脂乳中加入3%的發酵劑，于37.8℃恒溫箱中培養3.5h，測定酸度，若滴定乳酸度達0.8%以上，認為活力良好。

1.3.2 乳酸菌計數

采用血球板計數法[4］計算乳酸菌。

1.3.3 乳酸菌的鏡檢[4，7］

采用特殊的染色法——甲苯胺藍染色法，即涂片固定后，用0.2%的甲苯胺藍染色液染色2min，再用1%的乙酸溶液脫色數秒，即可使涂片中的菌體著染藍色，而且背景呈現白色或無色，菌體形狀十分清晰，即使涂片很厚且不勻也能看清菌體，便于菌體細胞計數和形體觀察。通過甲苯胺藍染色觀察分離培養的乳酸菌，根據乳酸菌的性質，看是否有其它雜菌，若有，挑取變為黃色的菌落，繼續劃平板培養，直到鏡檢全是乳酸菌為止。

2 結果與討論

2.1 保加利亞乳桿菌分離培養基pH值的確定

由于保加利亞乳桿菌在pH值為5或更低的情況下可生長、嗜熱鏈球菌在pH值較低的情況下不生長，為了確定乳桿菌能生長而鏈球菌不能生長的合適pH值，以保加利亞乳桿菌革蘭氏染色的鏡檢結果及菌落生長狀況為指標進行pH值單因素實驗。挑取分離得到的乳酸菌菌落，接種到保加利亞乳桿菌分離培養基中，于42℃厭氧培箱中培養48h，用革蘭氏染色進行鏡檢，結果見表1 。

表1 保加利亞乳桿菌革蘭氏染色鏡檢結果Tab.1 Microscopic examination results of Gram－staining for Lactobacillus bulgaricus

由表1 可以看出，保加利亞乳桿菌分離培養基的pH值為5.0時，分離效果最佳。

2.2 保加利亞乳桿菌性質鑒定

保加利亞乳桿菌菌落特征為：菌落呈中等大小，微白色，濕潤，邊緣不整齊，如棉絮團狀。屬革蘭氏陽性桿菌，菌體寬度小于2μm，常表現出長桿狀，多呈線狀，常有卷曲，幼齡時單個或成對。符合文獻[8］對保加利亞乳桿菌形態的描述。

將鑒定過的保加利亞乳桿菌接種到脫脂乳中，于不同溫度下培養發酵。結果發現，保加利亞乳桿菌在39～44℃時約4h凝乳；當培養溫度超過44℃時，隨著溫度的升高，凝乳時間延長；當培養溫度超過53℃時，不能凝乳；當培養溫度低于39℃時，隨著培養溫度的降低，凝乳時間延長；當培養溫度低于23℃時，不能凝乳。

分離到的桿菌在含膽汁酸鹽的液體培養基、含2%氯化鈉的液體培養基、含0.4%酚的培養基中均能生長，而在含0.5%酚的培養基中不能生長。進一步證明，分離到的桿菌是保加利亞乳桿菌。

2.3 嗜熱鏈球菌分離培養基pH值的確定

由于嗜熱鏈球菌在pH值為9.2的情況下能生長、保加利亞乳桿菌在pH值較高的情況下不生長，為了確定嗜熱鏈球菌能生長而保加利亞乳桿菌不能生長的合適pH值，以嗜熱鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結果及菌落生長狀況為指標進行pH值單因素實驗。挑取分離得到的乳酸菌菌落，接種到嗜熱鏈球菌分離培養基中，于42℃厭氧培養箱中培養48h，用革蘭氏染色進行鏡檢，結果見表2 。

表2 嗜熱鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結果Tab.2 Microscopic examination results of Gram－staining of Streptococcus thermothillus

由表2 可以看出，嗜熱鏈球菌分離培養基的pH值為9.0時，分離效果最佳。

2.4 嗜熱鏈球菌性質鑒定

嗜熱鏈球菌菌落特征為：菌落光滑，微白色，邊緣整齊。屬革蘭氏陽性球菌，黃色，菌落較大，生長良好，菌落卵圓形，表面光滑，凸起，符合文獻[8］對嗜熱鏈球菌形態的描述。

將分離得到的嗜熱鏈球菌接種到脫脂乳中，于不同溫度下培養發酵。結果發現，嗜熱鏈球菌在39～46℃時約4h凝乳；在46～50℃時，隨著溫度的升高，凝乳時間延長；當培養溫度超過54℃時，不能凝乳；當培養溫度低于39℃時，隨著培養溫度的降低，凝乳時間延長；當培養溫度低于21℃時，不能凝乳。

分離到的球菌在含2%氯化鈉的液體培養基、0.1%的鎂藍牛乳中不能生長。進一步證明，分離到的球菌是嗜熱鏈球菌。

2.5 乳酸單菌與混合菌發酵酸乳品的性質比較（表3 ）

表3 乳酸單菌及混合菌發酵的酸乳品性質比較Tab.3 Performance comparison of yogurts fermented by Lactobacillus bulgaricus，Streptococcus thermothillus or their mixture

由表3 可知，乳酸單菌發酵效果沒有球桿混合菌的效果好。

2.6 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌配比的確定

分別取活化后的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌1mL，用無菌水進行10倍法均勻稀釋，取10－6、10－7、10－83種稀釋度，用混合平板法培養，凝固后于37℃厭氧培養箱中培養，然后進行菌落計數，結果見表4。

由表4可以看出，1mL活化菌懸液中，保加利亞乳桿菌的數量是嗜熱鏈球菌數量的25倍，因此在制發酵劑時，可以取1mL桿菌活化液和25mL或12.5mL球菌活化液進行混合，這樣混合制得的發酵劑中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例可以控制在（1～2）∶1之間。

表4 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的平板計數結果Tab.4 Count results of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermothillus

2.7 工作發酵劑接種量的確定（表5 ）

表5 工作發酵劑接種量的確定Tab.5 Choose of inoculum amount of fermentation agent

由表5 可以看出，工作發酵劑接種量以3%為佳，可以制得酸味適中、香味濃郁的酸乳制品。

3 結 論

（1）利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適pH值不同，確定了當BCP培養基的pH值分別為5.0和9.0時，能將兩者有效分離。

（2）將分離開來的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按（1～2）∶1的比例混合制得酸奶發酵劑，以其作為乳酸菌菌種制得的酸乳品酸味適中、香味濃郁。

[1]萬紅兵，田洪濤，山麗杰，等.嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌麥芽復合汁增菌培養基的優化篩選[J］.食品與發酵工業，2006，32（6）：51－55.

[2]王俊英，張杰.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離和性能研究[J］.周口師范學院學報，2012，29（2）：89－91.

[3]李志成，徐懷德，王敏，等.嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌增菌培養研究[J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2002，（Z1）：50－52.

[4]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M］.北京：中國輕工業出版社，1999：84－88.

[5]趙麗麗.乳酸菌的分離鑒定及其在酸豆乳加工中的應用[D］.北京：北京工商大學，2009.

[6]袁麗紅.微生物學實驗[M］.北京：化學工業出版社，2010：207－208.

[7]昌加平.酸奶中乳酸菌鏡檢涂片的特殊染色法[J］.微生物學通報，1996，26（4）：281－282.

[8]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M］.北京：科學出版社，2001：371－385.