L－半胱氨酸與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜分析

徐大瑋，畢玉琦

（1.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，山東 濟南250100；2.山東質(zhì)量認證中心，山東 濟南250014）

L－半胱氨酸（L－Cysteine，L－Cys）是組成蛋白質(zhì)的重要氨基酸之一，其結構中既有羧基、氨基，又有巰基（－SH），具有重要的生理藥理功能。L－Cys能夠合成谷胱甘肽，還能維持細胞內(nèi)外的氧化還原狀態(tài)[1］，廣泛應用于生物醫(yī)藥[2］、檢測[3］、食品[4］等領域。在醫(yī)藥行業(yè)，L－Cys的鹽酸鹽具有恢復肝功能的作用，其衍生物可以作為溶解性祛痰劑[2］；在食品加工行業(yè)，L－Cys具有很好的食品保鮮、抗氧化作用；另外人們還將它應用到化妝品行業(yè)中[4］。

血清白蛋白能與進入體內(nèi)的許多物質(zhì)進行可逆結合，在體內(nèi)起到貯存、轉(zhuǎn)運物質(zhì)的作用。因此，研究小分子與血清白蛋白的相互作用對理解物質(zhì)在體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運等作用機制具有重要意義。牛血清白蛋白（BSA）因與人血清白蛋白（HSA）具有相似的結構，常作為體外模型蛋白用于研究。

目前，有關L－Cys與模型蛋白BSA相互作用的研究還很少見，方盈盈等[5］探討了L－Cys與BSA相互作用的熱轉(zhuǎn)變曲線、變性溫度和變性焓等，但是對于LCys與BSA的猝滅常數(shù)、結合作用以及熱力學參數(shù)的變化至今尚未見報道。作者在此運用熒光光譜法研究了L－Cys與BSA的熒光猝滅機制，求得了L－Cys與BSA的猝滅常數(shù)、結合常數(shù)、結合位點數(shù)和熱力學參數(shù)，為全面了解L－Cys在體內(nèi)的貯存、轉(zhuǎn)運、代謝作用以及L－Cys的藥理、毒理機制提供了依據(jù)。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（純度＞98%）、L－半胱氨酸（BR），國藥集團化學試劑有限公司；Tris試劑、NaCl，分析純；二次去離子水。

LS－55型熒光儀，美國 Perkin Elmer公司；DF－101S型集熱式恒溫槽，鞏義英峪儀器廠；FA2004B型電子天平，上海精密儀器；PH－3C型酸度計，上海鵬順。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

用電子天平準確稱取0.6057g Tris試劑和0.2925g NaCl，溶于50mL 二次去離子水中，并與42mL 0.1mol·L－1的鹽酸均勻混合，用二次去離子水定容至100mL，用酸度計測其pH值為7.4，即得到0.05mol·L－1pH＝7.4的 Tris－HCl緩沖溶液，溶液中NaCl的濃度為0.05mol·L－1。

用上述0.05mol·L－1Tris－HCl緩沖溶液配制濃度為1.24×10－6mol·L－1的BSA溶液，低溫保存，備用。

用電子天平準確稱取 0.6058g L－Cys，溶于50mL二次去離子水中，其濃度為0.1mol·L－1；取10mL上述溶液，稀釋至100mL，即得濃度為1.0×10－2mol·L－1的L－Cys水溶液。

1.2.2 熒光光譜分析

取5mL BSA于比色管中，依次加入不同體積的L－Cys水溶液（加入體積＜100μL，忽略體積對濃度的干擾），設定激發(fā)波長為285nm、掃描速率為500nm·min－1、熒光發(fā)射與激發(fā)狹縫比為8∶8，在溫度為288K、306K時測量BSA的熒光光譜，記錄350nm處的熒光強度，并運用相關公式進行數(shù)據(jù)處理；在288K時測L－Cys與BSA相互作用的同步熒光光譜，考察L－Cys對BSA結構的影響。

2 結果與討論

2.1 L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅光譜

蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）及苯丙氨酸（Phe）3種生色團而產(chǎn)生熒光。三者對于蛋白質(zhì)熒光強度的貢獻差別較大，相對熒光強度Trp∶Tyr∶Phe為100∶9∶0.5[6］，也就是說Trp對蛋白質(zhì)熒光的貢獻最大，特別是當激發(fā)波長為285nm時，蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的熒光性質(zhì)主要為Trp的熒光性質(zhì)。

不同溫度下，不同濃度L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅光譜見圖1。

圖1 不同溫度下，不同濃度L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA with L－Cys as quencher at different temperatures

由圖1可看出，288K時，BSA的最大熒光峰位于350nm處；隨著L－Cys濃度的增大，BSA的熒光強度不斷降低，發(fā)生了熒光猝滅，且最大發(fā)射峰從350nm藍移到了347.5nm。表明L－Cys與BSA之間發(fā)生了相互作用，L－Cys使BSA的Trp生色團的微環(huán)境發(fā)生了改變。

溫度對溶液的熒光有顯著的影響，溫度升高時由于分子內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用會使溶液的熒光強度下降[7］。由圖1可看出，288K時，BSA的熒光強度為734，而306K時BSA的熒光強度下降至538；當LCys的濃度為23.1×10－5mol·L－1時，288K、306K下的熒光強度分別為472和353，表明溫度對L－Cys與BSA的相互作用影響顯著。

2.2 L－Cys與BSA相互作用的熒光猝滅機制

熒光猝滅是熒光物質(zhì)與其它分子之間作用，導致熒光強度降低的過程。熒光猝滅的過程非常復雜，常見的有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，動態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)熒光分子和其它分子之間碰撞造成能量損失而形成的，其能量以無輻射形式躍遷回基態(tài)，溫度越高猝滅越明顯；而靜態(tài)猝滅是形成基態(tài)復合物而導致的，受溫度影響較小[7］。猝滅機制可以通過Stern－Volmer方程[式（1）］來研究[8，9］：

式中：F0和F分別為猝滅劑不存在和存在時體系的熒光強度；Ksv為Stern－Volmer猝滅常數(shù)；[Q］為猝滅劑的濃度。

繪制不同溫度下的L－Cys對BSA熒光猝滅的Stern－Volmer曲線，見圖2。

圖2 不同溫度下，L－Cys與BSA相互作用的Stern－Volmer曲線Fig.2 The Stern－Volmer curves of the interaction between L－Cys and BSA at different temperatures

由圖2可看出，Stern－Volmer曲線斜率隨著溫度的升高而增大，計算得到288K、306K時的Ksv分別為1.69×103L·mol－1、1.89×103L·mol－1。表明，L－Cys與BSA相互作用的猝滅機制為動態(tài)猝滅。

2.3 L－Cys與BSA的結合作用及熱力學參數(shù)

L－Cys與BSA 的結合作用可由式（2）表示[8，9］：

圖3 不同溫度下，L－Cys與BSA相互作用的log[（F0－F）／F］～log[Q］曲線Fig.3 Plots of log[（F0－F）／F］versus log[Q］of the interaction between L－Cys and BSA at different temperatures

由圖3中曲線的斜率和截距求出L－Cys與BSA相互作用的結合常數(shù)K及結合位點數(shù)n，見表1 。

表1 不同溫度下的結合常數(shù)、結合位點數(shù)及熱力學參數(shù)Tab.1 Binding constants，binding sites，and the thermodynamic parameters at different temperatures

由表1 可看出，隨著溫度的升高，結合常數(shù)和結合位點數(shù)均相應增大。

當溫度變化不大時，反應的焓變（△H）可以看作常數(shù)，根據(jù)van′t Hoff公式[式（3）］和熱力學公式[式（4）］求出反應的熵變（△S）和吉布斯自由能（△G），結果見表1 。

蛋白質(zhì)與小分子之間的結合主要有疏水作用力、范德華力、氫鍵和靜電引力[10］，不同小分子與蛋白質(zhì)結合的作用力類型不盡相同，當△H＞0、△S＞0時，主要作用力為疏水作用力[11］。

由表1 可看出，△H＞0，說明該反應過程是一個吸收熱量的過程，升高溫度有利于反應的進行，這也與實際相符；△H＞0、△S＞0，可以判斷L－Cys和BSA之間的作用力主要為疏水作用力；此外，L－Cys的等電點在5.05左右，BSA的等電點在4.6左右，實驗的pH值為7.4，因此L－Cys和BSA都帶負電，二者之間存在較大的靜電斥力，這也導致二者的結合作用力較小；考慮到水溶液中水分子和其它共存離子的影響，實際體系的宏觀表現(xiàn)應該是幾種作用力同時作用的結果。

2.4 L－Cys與BSA相互作用的同步熒光光譜

蛋白質(zhì)中Trp和Tyr殘基的熒光峰位置與蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境密切相關，因此可以通過熒光峰位置的改變來判斷蛋白質(zhì)微環(huán)境的改變。Trp和Tyr的同步熒光光譜見圖4。△λ＝60nm時，主要是Trp的熒光光譜特征；△λ＝15nm時，主要是Tyr的熒光光譜特征[12］。

圖4 L－Cys與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BSA with L－Cys as quencher

由圖4可看出，隨著L－Cys濃度的增大，Trp的最大發(fā)射峰略有藍移，熒光強度逐漸降低；而Tyr的最大發(fā)射峰位置沒有大的變化。表明Trp所處的微環(huán)境疏水性增強、極性減弱，這也與L－Cys和BSA之間的作用力主要是疏水作用力相一致。

3 結論

在模擬動物活體生理條件下，運用熒光光譜法研究了L－Cys與BSA的相互作用。結果表明，L－Cys對BSA的熒光具有猝滅作用，其猝滅機制為動態(tài)猝滅；L－Cys與BSA之間的作用力主要為疏水作用力；同步熒光光譜顯示，L－Cys使得BSA的Trp微環(huán)境發(fā)生改變，疏水性增強、極性減弱。

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