大慶聚合物驅后二類油層細菌群落結構及其多樣性分析

張繼元

（中國石油大慶油田有限責任公司 勘探開發研究院，黑龍江 大慶163712）

大慶薩中開發區中新201注聚站是薩Ⅲ組二類油層開展聚合物驅較早的區塊之一[1］。2002年9月開始注聚合物，2002年12月見效，2003年5月到達產量高峰期，2004年6月含水率開始回升，經過多年聚合物驅開發，階段提高采收率9.48%，目前已進入后續水驅[2］。為了將聚合物驅后油藏中的剩余油作為挖潛對象，有必要開展內源微生物驅油提高采收率的可行性研究[3，4］。

認知油藏微生物的種群多樣性、群落變化和演替是開發、調控、應用油藏微生物采油技術的關鍵。以往采用傳統培養方法分析大慶內源微生物的群落組成[5，6］，所獲信息不全面，很難對油藏中的微生物群落結構進行準確的分析，因而無法掌握環境中微生物群落的真實情況[7］。為此，近年來通過分子生物學方法研究大慶聚合物驅、水驅和過渡帶油藏微生物的報道很多[8－12］，其中多聚酶鏈式反應（PCR）－變性梯度凝膠電泳（DGGE）方法被廣泛應用于分析油藏微生物群落結構并監測微生物群落動態變化[13－15］。

作者利用PCR－DGGE技術對薩中開發區薩Ⅲ組二類油層的細菌群落進行分析，揭示注采系統中微生物群落的結構、多樣性和分布變化，擬為聚合物驅后油藏開展內源微生物驅油提供參考。

1 實驗

1.1 樣品的采集及預處理

樣品取自中新201注聚試驗區的5口注水井和9口采油井的采出液，開采層系為薩Ⅲ組二類油層，地層溫度為41～45℃，地下原油粘度為9.3mPa·s，原始地層水礦化度約為7000mg·L－1。

現場用滅菌的塑料桶從注水井和采油井中收集水樣，采集后迅速運送至實驗室，進行DNA提取和后續分析。將水樣在4℃下以6000r·min－1離心15min，獲得菌體。用10mL正己烷溶解離心管中剩余油樣，充分振蕩后，以10 000r·min－1離心15min，得到的菌體用pH值7.2的磷酸鹽緩沖溶液充分洗滌后與水相中的菌體合并，立刻進行基因組提取或保存于－20℃。

1.2 水樣微生物基因組的提取

采用玻璃珠研磨－酶法－SDS相結合的方法提取基因組，具體步驟：（1）將離心所得菌體重懸于1mL Lysis buffer（50mmol·L－1Tris，40mmol·L－1EDTA，0.1mol·L－1NaCl，pH 值8）中，加入0.3g直徑0.1mm的玻璃珠，以4800r·min－1渦旋1min，然后冰浴1min，反復3次。（2）加入10mg·mL－1溶菌酶，輕輕混勻，于37℃保溫1h后加入100μL 20%SDS和200μL蛋白酶K，混勻后于65℃保溫30min；加入與上清液等量的酚－氯仿－異戊醇溶液（體積比25∶24∶1），進行蛋白抽提，反復抽提直至中間沒有明顯的蛋白層為止。（3）將上層清液轉移到新離心管中，加入0.6BV的異丙醇溶液，室溫靜置30min；在4℃下，以10 000r·min－1離心15min，棄上層清液，加入1mL體積分數為70% 的乙醇洗滌，離心，風干沉淀，溶于適量 TE緩沖溶液（10mmol·L－1Tris，1mmol·L－1EDTA，pH 值8.0）中。（4）用質量分數為0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的基因組。

1.3 細菌16SrDNA基因高可變區的擴增

用細菌16SrDNA基因的通用引物擴增16SrDNA基因高可變區片段，大小約390bp。引物分別為1055f和1406r－GC（其中f為正向引物；r為反向引物；GC是一段大小約40bp的富含GC的序列，其序列為5′－CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCC－3′）；引物序列分別為5′－ATGGCTGTCGTCAGCT－3′和5′－ACGGGCGGTGTGTAC－3′。

采用Touch Down PCR，反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性45s，退火45s，72℃延伸90s（退火溫度從60℃降至52℃，共20個循環），之后再進行15個循環（94℃變性1min，55℃退火1min，72℃變性3min），72℃延伸10min，4℃終止。

1.4 變性梯度凝膠電泳

利用 DcodeTMUniversal Mutation Detection System（Bio－Rad）進行DGGE分析。

細菌16SrDNA基因高變區的DGGE條件為：質量分數為6%的聚丙烯酰胺凝膠，質量分數為40%～60%的變性劑（100%的變性劑是濃度為7mol·L－1的尿素和質量分數為40%的去離子甲酰胺的混合物），上樣量為200ng，緩沖溶液為1×TAE，于60℃、160V下電泳3.5h。

電泳結束后，用10mg·mL－1EB染色15min，脫色，通過Bio－Rad凝膠成像系統成像，用Quantity One軟件對圖像進行分析。

用聚丙烯酰胺凝膠回收試劑盒（日本Bioflux公司）回收其中的優勢片段，再次用對應的不帶“GC”的16SrDNA高可變區引物擴增，然后按適當比例連接到pMD19－T載體上，轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選插入片段正確的克隆，送至北京三博遠志生物公司測序。

1.5 DNA片段序列分析

將所測的序列在GenBank中進行相似性序列比對，以確定其進化地位和親緣關系，序列差異小于3%的被認為屬于同一種系型，采用Clustal X 1.8進行序列比對，用 Mega 3.1軟件中的 Neighbor－joining算法進行各序列間的同源性和進化距離的分析和比較，構建系統進化樹。

2 結果與討論

2.1 薩Ⅲ組二類油層細菌群落結構的DGGE分析

細菌用引物1055f和1406r－GC擴增到16SrDNA基因高可變區，作為DGGE的樣品，上樣量為200ng，DGGE圖譜如圖1所示。

圖1 細菌16SrDNA基因高可變區DGGE圖譜Fig.1 DGGE Profiles of the high various region of 16SrDNA in bacteria

將圖1中所標注的各個條帶回收，經克隆后測序得到各條帶的序列信息，然后在GenBank數據庫中比對，獲得與其親緣關系最近的序列及所代表的細菌種屬信息。用 Clustal X 1.8和 Mega 3.1進行各序列間的同源性和進化距離的分析與比較，以Neighbor－joining連接方式構建系統進化樹，如圖2所示。

從DGGE圖譜（圖1）和系統進化樹（圖2）可以看出，5口注水井中檢測出的細菌主要是屬于γ－變形菌綱的 Acinetobacter（Band 2h）、Pseudomonas（Band 1h、6h）、Enterobacteriaceae（Band 7h、8h、10h、11h）以及少量的Bacillus（Band 14h），屬于β－變形菌綱的Thauera（Band 15h）和 Hydrogenophaga（Band 16h）。主要優勢菌群為α－變形菌綱（8.56%）、β－變形菌綱（9.62%）、γ－變形菌綱（19.15%）、網團菌門（3.18%）、壁厚菌門（3.19%）、梭桿菌門（1.60%）和未培養細菌（67.90%）。

圖2 16SrDNA基因高可變區序列DGGE所代表的細菌系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the DGGE bands in 16SrDNA high various region

9口采油井中檢測出的細菌主要是屬于β－變形菌綱的Azoarcus（Band 17h、19h）、Thauera（Band 18h、20h、22h、36h）和Petrobacter（Band 26h），γ－變形菌綱的Pseudomonas（Band 25h、27h）、Acinetobacter（Band 2h）和Escherichia（Band 23h），ε－變形菌綱的Acobacter（Band 34h）以及Chloroflexi（Band 35h）。優勢菌群為ε－變形菌綱（2.71%）、β－變形菌綱（3.26%）、壁厚菌門（3.25%）和未培養細菌（90.24%）。

5口注水井的菌群結構相似，應該是由于采出液長期回注，使注水井中的細菌種類趨于穩定。其中3種優勢菌群也都是油藏中常見的細菌種屬，推測可能是采油井從注水井中帶出的采出液，且能適應外界開放環境的油藏內源細菌。9口采油井之間細菌群落的差異較大，優勢菌群也不盡相同。B1－2－P30和B1－2－P130這2口中心井的細菌種類相似，但是數量有差別，主要的優勢菌群是Thauera、Petrobacter、Escherichia、Pseudomonas以及未培養細菌。

在注采井中檢測到的優勢菌群Acinetobacter、Pseudomonas和Thauera均是油藏中常見的細菌，其最適宜生長溫度為33～45℃，一些菌株具有產表面活性劑、乳化原油、降解長鏈烷烴的功能。其中Thauera是兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，具有反硝化能力，在以乙酸鹽、丙酸鹽和乙醇等進行硝化作用時可降解多環芳烴類物質，在廢水處理中應用較多。Pseudomonas屬的某些菌種具有烴降解功能，有的還可以產生生物表面活性劑和一些小分子物質。Acinetobacter的某些菌種可產生生物表面活性劑，在采油中也有很好的應用。上述菌屬中的優勢菌群對于采油具有非常重要的意義[16］。

2.2 薩Ⅲ組二類油層細菌群落的多樣性

細菌文庫反映了細菌群落組成及占主要地位的細菌種類。分別對注水井 B1－330－P41和采油井 B1－2－P130中的微生物多樣性進行分析，建立了16SrDNA克隆文庫。其中注水井獲得83個操作分類單元（OTUs）、采油井獲得22個操作分類單元（OTUs），兩者獲得的細菌文庫覆蓋率分別為65.60%和92.93%，庫容值較大，覆蓋程度高，具有較好的代表性[14］。注水井的細菌Shannon－Wiener多樣性指數為0.9615，高于采油井的0.7666，表明注水井的細菌多樣性高于采油井。原因可能是，在聚合物驅后的油藏環境中，隨著注入水進入油藏，部分細菌因油藏孔道的截留或不適應厭氧環境而死亡，只有部分種屬的細菌存留下來，因而采油井中的細菌多樣性有所降低。注入水和采出液樣品中細菌16SrDNA克隆文庫分析結果見表1 。

表1 注入水和采出液樣品中細菌16SrDNA克隆文庫分析結果Tab.1 The 16SrDNA gene clone libraries analysis of bacteria in injection water and production liquor samples

從表1 可明顯看出，可培養細菌Thauera、Syntrophotherms lipocalidus、Clostridium 和Syntrophus僅占樣品中16SrDNA克隆文庫的4.88%，其余94.54%為未培養細菌，這表明未培養細菌在聚合物驅后油藏的微生物群落結構中起到重要作用[17］。

3 結論

（1）在聚合物驅后的薩Ⅲ組二類油層中，注水井、采油井檢測的細菌主要優勢菌群為α－、β－、γ－、ε－變形菌綱以及少量的網團菌門、壁厚菌門和梭桿菌門等，未培養細菌在注水井、采油井中所占比例較大，分別為67.90%（注水井）和90.24%（采油井）。

（2）在聚合物驅后的薩Ⅲ組二類油層中，注水井的細菌菌群結構相似，采油井之間的細菌菌群差異較大，優勢菌群也不盡相同，其中Pseudomonas、Acinetobacter和Thauera 3種優勢菌群在注水井、采油井中均被檢測到。

（3）聚合物驅后注水井B1－330－P41和采油井B1－2－P130的細菌克隆文庫分別獲得83個和22個操作分類單元，庫容值較大，覆蓋率高，具有較好的代表性。兩者對應的Shannon－Wiener多樣性指數分別為0.9615和0.7666，表明聚合物驅后薩Ⅲ組二類油層中注水井的細菌多樣性高于采油井。

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