柚皮黃酮抑制硝化和氧化作用的研究

羅云敬，朱西平，安學(xué)靜，王 珺

（北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124）

黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等功能[1，2］，因此，研究天然產(chǎn)物中黃酮類化合物的生物與化學(xué)特性十分重要。蕓香科植物柚子產(chǎn)量高，其果皮中除含有芳香油、果膠和色素外，還含有豐富的黃酮類物質(zhì)[3－5］。柚皮中黃酮類化合物可分為蘆丁（蕓香苷）、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷[3，6］4種，其中，新橙皮苷與橙皮苷的二苯基色原酮部分結(jié)構(gòu)相同。

目前的研究主要集中在柚皮黃酮類化合物的提取工藝和其中單一成分的性質(zhì)方面，針對(duì)柚皮黃酮清除自由基的作用研究還較少，對(duì)其中的關(guān)鍵作用成分還不明確。

鑒于此，作者采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定酪氨酸硝化產(chǎn)物3－硝基酪氨酸（3－NT）的有效含量，評(píng)價(jià)蘆丁、柚皮苷、橙皮苷3種柚皮黃酮在抑制過(guò)氧亞硝酸根硝化損傷酪氨酸（Tyr）方面的作用，并測(cè)定3種柚皮黃酮對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基）的清除效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 3－硝基酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制1mg·mL－1的3－硝基酪氨酸溶液，用0.05mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 過(guò)氧亞硝酸根溶液的制備

取100mL堿性 H2O2溶液（pH 值為12.5～13.0）與等摩爾量的亞硝酸異戊酯，在0～4℃（冰水混合物）反應(yīng)9h左右；用MnO2清除剩余H2O2溶液，所得溶液和1mol·L－1NaOH溶液于－20℃混合，即得27mmol·L－1過(guò)氧亞硝酸根溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 柚皮黃酮類化合物對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用測(cè)試

將過(guò)氧亞硝酸根溶液分步稀釋、加入到含4mmol·L－1的酪氨酸、不同濃度柚皮黃酮（蘆丁、柚皮苷、橙皮苷）的磷酸鹽緩沖溶液（pH＝7）中，最終體積為3 mL，37℃恒溫水浴60min，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定3－硝基酪氨酸在365nm處的吸光度[7］。

1.4 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)

取0.5mL 9mmol·L－1FeSO4、0.5mL 9mmol·L－1水楊酸－乙醇、1mL不同濃度的柚皮黃酮，混合均勻后，加入1mL 9.8mmol·L－1H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，最終體積為3mL，37℃水浴加熱60min，在510 nm下測(cè)定吸光度，以抗壞血酸（Vc）作陽(yáng)性對(duì)照。按式（1）計(jì)算羥基自由基清除率[8］：

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入柚皮黃酮溶液后的吸光度；Ax0為不加顯色劑 H2O2時(shí)的吸光度。

1.5 鄰苯三酚自氧化率測(cè)定

將2.8mL Tris－HCl緩沖溶液、0.1mL超純水混勻置于試管中，另取0.1mL酸性鄰苯三酚置于另－試管中放置；25℃預(yù)熱后，立即將兩試管溶液在比色皿中混勻并用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物的吸光度隨時(shí)間的變化。檢測(cè)時(shí)間為3min。平行測(cè)定3次，取平均值。

1.6 清除超氧陰離子自由基實(shí)驗(yàn)

樣品體系（最終濃度）：50mmol·L－1緩沖溶液（pH 值7.8）、80mmol·L－1酸性鄰苯三酚、不同濃度的柚皮黃酮溶液。以超純水代替柚皮黃酮作為對(duì)照體系。以抗壞血酸（VC）作陽(yáng)性對(duì)照。按式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率[9］：

式中：△A0為鄰苯三酚自氧化的速率；△A1為清除超氧陰離子自由基后鄰苯三酚自氧化的速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 清除羥基自由基的效果（表1 ）

由表1 可看出，當(dāng)柚皮苷的濃度為0.4μg·mL－1時(shí)，清除率為46.8%；當(dāng)柚皮苷濃度達(dá)到1.0μg·mL－1時(shí)，清除率高達(dá)81.6%，幾乎是0.4μg·mL－1時(shí)的2倍。橙皮苷在2.0μg·mL－1時(shí)的清除率幾乎是0.6μg·mL－1時(shí)的4倍。蘆丁在10μg·mL－1時(shí)的清除率為88.4%，是2μg·mL－1時(shí)的16倍。蘆丁的作用濃度要高于柚皮苷和橙皮苷，蘆丁在濃度2μg·mL－1時(shí)的清除率只有5.5%，而該濃度下橙皮苷的清除率達(dá)到68.5%，柚皮苷更是在1.0μg·mL－1時(shí)清除率就高達(dá)81.6%。

文獻(xiàn)報(bào)道的清除羥基自由基的天然產(chǎn)物的濃度基本是在 mg·mL－1水平[10，11］，而本實(shí)驗(yàn)柚皮黃酮在μg·mL－1水平就已經(jīng)表現(xiàn)出非常好的清除作用。

由表1 還可看出，3種黃酮類化合物在μg·mL－1水平清除羥基自由基的效果非常理想，且清除率均表現(xiàn)出良好的濃度依賴關(guān)系，清除50%羥基自由基所需要的化合物濃度（IC50）分別為：蘆丁8.0μg·mL－1、柚皮苷0.8μg·mL－1、橙皮苷1.0μg·mL－1，清除作用大小依次為：柚皮苷＞橙皮苷＞蘆丁，柚皮苷清除羥基自由基的作用最強(qiáng)，是蘆丁的10倍、橙皮苷的1.25倍。

表1 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷清除羥基自由基的效果Tal.1 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing·OH

2.2 對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用（表2 ）

表2 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸的抑制作用Tab.2 Effects of rutin，naringin，hesperidin on inhibiting the nitration of tyrosine by peroxynitrite

由表2 可看出，當(dāng)蘆丁、橙皮苷濃度為10μg·mL－1時(shí)，3－硝基酪氨酸的濃度分別為0.412mg·mL－1、0.407mg·mL－1，與對(duì)照相近；當(dāng)柚皮苷的濃度從2μg·mL－1增加到10μg·mL－1時(shí)，3－硝基酪氨酸的濃度從0.409mg·mL－1降至0.380mg·mL－1。表明，柚皮苷對(duì)過(guò)氧亞硝酸根硝化具有抑制作用，且該抑制作用具有濃度依賴性，而蘆丁和橙皮苷沒(méi)有明顯的抑制硝化的作用。

2.3 清除超氧陰離子自由基的效果（表3 ）

表3 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷清除超氧陰離子自由基的效果Tab.3 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing

表3 蘆丁、柚皮苷、橙皮苷清除超氧陰離子自由基的效果Tab.3 Effects of rutin，naringin and hesperidin on removing

樣品 濃度／μg·mL－1 清除率／%蘆丁16 17.24柚皮苷 16 13.79橙皮苷16 10.35

由表3 可看出，當(dāng)蘆丁、柚皮苷、橙皮苷濃度為16 μg·mL－1時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為17.24%、13.79%和10.35%。表明，柚皮黃酮在μg·mL－1水平顯示出清除超氧陰離子自由基的作用，作用大小依次為：蘆丁＞柚皮苷＞橙皮苷。

2.4 討論

本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)較為全面的評(píng)價(jià)或篩選天然產(chǎn)物抑制或清除ONOO－、和·OH等自由基的方法。ONOO－能再分解生成和·OH，從而導(dǎo)致硝化損傷，而·OH會(huì)導(dǎo)致氧化損傷。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH[10］，3種柚皮黃酮對(duì)·OH 均在μg·mL－1水平表現(xiàn)出濃度依賴的清除作用。可以由和NO·結(jié)合而生成，清除對(duì)于抑制ONOO－的硝化作用也具有非常重要的意義。

3 結(jié)論

以抑制過(guò)氧亞硝酸根硝化酪氨酸生成3－硝基酪氨酸評(píng)價(jià)了柚皮黃酮的抗硝化作用；以Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基體系和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基體系，用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定了柚皮黃酮對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除效果。結(jié)果表明，柚皮苷的抗硝化作用較強(qiáng)，而蘆丁和橙皮苷沒(méi)有明顯的抗硝化作用；3種柚皮黃酮清除羥基自由基的效果在μg·mL－1水平就已經(jīng)比較顯著（超過(guò)50%），且顯示出濃度依賴性，作用大小依次為：柚皮苷＞橙皮苷＞蘆丁；3種柚皮黃酮在μg·mL－1水平清除超氧陰離子自由基的作用大小依次為：蘆丁＞柚皮苷＞橙皮苷。

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