野生型和轉基因植物修復TNT的研究進展

連桂云，劉均洪

（青島科技大學化工學院，山東 青島266042）

大規模生產和加工彈藥產生的化合物已經造成嚴重的環境污染，這些化合物在軍事射擊場、戰區、炸藥生產地區均可以發現[1］，如 TNT（2，4，6－三硝基甲苯）、RDX（1，3，5－三硝基－1，3，5－三氮雜環己烷，又稱環三亞甲基三硝胺、黑索今）和 HMX（1，3，5，7－四硝基－1，3，5，7－四氮雜環辛烷，又稱環四亞甲基四硝胺、奧克托今）[2］。土壤中濃度最高的是TNT，達到4000～10 000mg·kg－1，極端情況下甚至達到87 000mg·kg－1[3，4］。TNT 及其轉化產物都是有毒的，蚯蚓急性毒性試驗表明，其半致死量為143mg·kg－1[5］。TNT被美國環境保護局確認為潛在的致癌物（C類），直接接觸，可導致貧血、肝功能紊亂、皮膚刺激或免疫系統的損害[1］。227.13，logKOW（辛醇－水分配系數）為0.87，水溶性為0.15%，難于降解，會在環境中持久存在，對生物產生負面影響。因此，對TNT污染土壤和污染水進行修復十分重要。目前的修復方法主要為焚燒、吸附、化學氧化法，不僅耗時、成本高，而且焚燒法因NOx的排放會造成額外的環境問題，化學氧化法也可能會產生有毒的副產物，因此，其應用受到限制。生物法利用具有潛在修復能力的微生物和植物來清潔環境，是近年來新興的修復方法。一些細菌可以利用TNT作為氮源，從而產生修復能力，但可能會因為其它有毒的底物失去活性[6］。植物修復是一種利用綠色植物修復TNT土壤污染和水污染的方法，成本低、適應性強，并且其耐受TNT的能力要比微生物強。因此，植物修復TNT土壤污染和水污染的效果更好。

作者在此對植物修復TNT水污染和土壤污染的最新成果進行綜述。

1 植物修復TNT的優缺點

植物修復有很多優點，如地區適應性強、成本低、不需要具體的設備、不會再引入新的污染物質、容易被社會接受等。它適用于logKOW＝0.3～3之間的化合物，這些化合物可以進入根內皮層，利于植物吸收。植物修復效率取決于pH值、pKa（電離常數）、有機物含量、植物生理特性、土壤環境－濕度和土壤組成等因素。植物修復也存在缺點：當污染地區TNT濃度過高時，會對植物產生毒性從而抑制植物的修復作用[7］；修復時間長，并且修復作用只能發生在植物的根部。

2 利用野生型植物修復TNT

目前，大多數研究分析了植物對水中TNT的修復情況，發現植物可以在很短的時間內吸收水中大多數的TNT，而對土壤中TNT的植物修復情況研究報道較少。

Best等[8］研究發現，在地下水中，當TNT初始濃度為681μg·L－1（0.003mmol·L－1）時，10d內可以被10種水生植物降解94%～100%。研究表明，當水中TNT初始濃度為0.11mmol·L－1時，Myriophyllum aquaticum 可以在15d內降解全部的TNT[9］。Hughes等[10］研究發現，當水中 TNT 初始濃度為0.44mmol·L－1時，Myriophyllum aquaticum可以在5d內降解全部的TNT；Myriophyllum spicatum在7d內可以完全轉化初始濃度為0.35 mmol·L－1的TNT，植物吸收量為1.6mg·g－1，植物密度為50gl·L－1，明顯高于Pavlostathis等[11］測得的植物吸收量 （0.29mg·g－1）。Catharanthus roseus是另一種可以在介質中除去TNT的植物，當TNT初始濃度為0.44mmol·L－1時，它可以在5d內降解全部的 TNT[10］。

上述水生植物在實驗室條件下可以很好地發揮作用，但是由于地區差異，它們在其它地區可能不能很好地生長。此時，就可以利用沼生植物來修復TNT。Nepovim等[12］研究發現，常見的蘆葦（Phragmites australis）、綠色燈芯草（Juncus glaucus）、莎草（Carem gracillis）和香蒲（Typha latifolia）可以在10d內從液體介質中降解接近90%的TNT（初始濃度為0.44mmol·L－1），其中效果最好的是蘆葦，它還可以降解污染土壤中98%的TNT。Best等[13］研究發現，菖蒲（Acorus calamus）、草蘆（Phalaris arundinacea）和蒯草 （Scirpus cyperinus）可以在7d內從地下水中吸收90%的TNT。

研究人員還研究了在水環境中陸生植物吸附TNT的能力。Adamia等[1］研究了8種植物吸收TNT的能力，發現大豆（Glycine max）吸收TNT的能力最強，吸收量為0.21mg·g－1；鷹嘴豆（Cicer arietinum）和毒麥（Lolium multiflorum）的吸收能力較弱。毒麥可以在72h內將初始濃度為100μmol·L－1的 TNT 降解94.3%。

Makris等[14］研 究 發 現，香 根 草 （Vetiveria zizanioides）可以在8d內將水溶液中初始濃度為0.18 mmol·L－1的TNT全部吸收，植物吸收量為1.03mg·g－1；如果在溶液中加入離液劑（含尿素和硫脲），可以破壞水的結構，增加疏水性化合物TNT的溶解性，從而促進植物對TNT的吸收。實驗證明，當加入離液劑時，在30min內TNT可以降解25%；而不加離液劑時，在相同的時間內TNT只降解10%。

香根草消除土壤中TNT也是非常有效的。Das等[15］研究發現，在土壤中TNT初始濃度為40mg·kg－1時，香根草可以在3d內降解97%的TNT；當TNT初始濃度為80mg·kg－1時，3d內降解39%的TNT，12d內降解88%的TNT。在土壤中加入離液劑（0.1%）會促進植物對TNT的吸收，當TNT濃度較高時，這種作用更明顯。

Chang等[16］研究了青麻（Abutillon avicennae）對土壤中TNT的修復。當土壤中TNT的初始濃度為120mg·kg－1時，50d后，含青麻土壤中TNT的剩余含量為23.2%，而不含青麻土壤中TNT的剩余含量為48.1%。

植物對TNT的修復研究成果見表1 。

以上研究表明，植物可以吸收環境中的TNT，此外，植物提取物中TNT的缺失表明植物有能力轉化TNT。大多數的轉化發生在植物的根部，這可以用14C和放射自顯影術進行分析[1］。已有很多研究報道，植物降解TNT的第一步產物為4－氨基－2，6－二硝基甲苯（4A26DNT）和2－氨基－4，6－二硝基甲苯（2A46DNT），此外，還檢測到很多不明的極性產物[12］；接下來的轉化是非生物氧化和氧化偶氮產物的形成；最后一步轉化產物大多為單糖或者二糖的共軛產物，它們可以存在于植物的細胞液或細胞壁中[4］。TNT在植物中的轉化涉及多種酶，包括硝基還原酶[17］、過氧化物酶、酚氧化酶、葡基轉移酶和谷胱甘肽－S－轉移酶，這些酶在糖和谷胱甘肽結合形成氨基衍生物的過程中起著非常重要的作用。

3 利用轉基因植物修復TNT

植物修復被認為是清潔環境中污染物的有效方法。但是，植物是自養生物，沒有有效代謝有機物的酶機制，這就導致植物修復過程緩慢并且不徹底。在過去的幾年內，很多研究致力于將植物進行遺傳改造，如通過細菌轉化法，在植物中引入可以編碼代謝TNT的酶（如硝基還原酶、細胞色素P450）的基因，以提高植物吸收和代謝TNT的能力。因此，轉基因植物吸收TNT的能力比野生型植物更強[18］。

第一個用于降解TNT的轉基因植物是煙草（Nicotiana tabacum），在其中引入了季戊四醇四硝酸酯（PETN）還原酶（從Enterobacter cloacae中分離，Enterobacter cloacae最初來源于含炸藥污染物的土壤中），它是硝基還原酶的一種，可以降解硝基酯和含硝基的炸藥化合物。轉基因煙草在TNT濃度為0.05mmol·L－1時能夠發芽生長，而這個濃度足以抑制野生型煙草的生長。有很多其它類型的硝基還原酶可以催化TNT上的硝基成為羥氨基和氨基衍生物。Hannink等[19］進行了轉基因煙草表達NfsI硝基還原酶（從Enterobacter cloacae中分離）的相關研究。72h內，轉基因煙草可以完全吸收水溶液中初始濃度為0.25mmol·L－1的TNT，而野生型煙草吸收TNT的能力卻不明顯；轉基因煙草可以耐受高濃度的TNT（0.5mmol·L－1），而0.5mmol·L－1的 TNT會導致野生型煙草死亡。Hannink等[20］還發現，TNT轉化產物（4－氨基－2，6－二硝基甲苯）與轉基因煙草的大分子結合能力要比與野生型煙草的結合能力更強。Travis等[21］研究表明，含硝基還原酶的轉基因植物在土壤中對TNT的耐受能力要比野生型的強。有報道稱，在應用轉基因植物的區域，當TNT濃度高時，植株根部的細菌數量和細菌群落的遺傳多樣性都有提高。

表1 植物對TNT的修復研究成果Tab.1 Research of phytoremediation of TNT by plants

Strand等[22］比較了轉基因煙草和野生型煙草對TNT的吸收能力，發現轉基因煙草耐受TNT的能力明顯高于野生型煙草；當土壤中TNT濃度大于500 mg·kg－1時，兩種煙草都會發育遲緩，導致萎黃病；但含硝基還原酶的轉基因煙草的嚴重程度要低于野生型煙草。當引入NfsI硝基還原酶（從Escherichia coli中分離）到擬南芥 （Arabidopsis thaliana）中時，轉基因植株吸收TNT的量是野生型的7～8倍。當TNT濃度達到250mg·kg－1時，轉基因擬南芥仍可以生長，而野生型擬南芥在TNT濃度為50mg·kg－1時生長就會受到影響。

另一種轉基因植物白楊（Populus tremula xtremuloides var.Etropole）表達了細菌中硝基還原酶基因pnrA，它可以比野生型白楊耐受和吸收更高濃度的TNT。在水中，轉基因白楊可以在TNT濃度為57 mg·L－1時生長，而野生型白楊在TNT濃度為11mg·L－1時生長就會受到明顯影響。在受污染的土壤中，野生型白楊可以耐受的TNT濃度為500mg·kg－1，而轉基因白楊可以耐受的TNT濃度為1000mg·kg－1。為了比較野生型白楊和轉基因白楊對TNT的吸 收 能 力，van Dillewijn 等[23］采 用 不 同 濃 度 的TNT進行比較研究。結果表明，在水中，在TNT濃度較低（20mg·L－1和35mg·L－1）的情況下，兩種白楊吸收TNT的能力相當；但是當TNT濃度達到50mg·L－1時，含pnrA的轉基因白楊降解TNT的速率明顯快于野生型白楊；在土壤中，轉基因白楊吸收TNT的能力也要明顯高于野生型白楊。

4 展望

植物具有修復環境中污染物的能力，環境中的TNT可以被很多植物吸收，吸收率一般在70%～100%。大多數情況下，在植物的根部區域發生一系列的轉化反應，TNT的轉化產物為單糖或者二糖的共軛產物，它們可以存在于植物的細胞液或細胞壁中。當水或土壤中TNT濃度高時，植物修復TNT的適用性受到限制。對于很多植物，當土壤中TNT濃度達到100～500mg·kg－1時，植物修復就受到限制。因此，植物修復方法只適用于環境中TNT濃度低的情況。

到目前為止，大多數研究都只是在實驗室中進行，而缺少植物修復的實際應用。此外，很多用來做實驗的植物是農業植物品種，這些植物是不建議用作植物修復的。因此，仍需繼續努力尋找具有高TNT吸收能力的植物。

轉基因植物可以選擇性地降解污染化合物，且其修復能力要比野生型植物更強。轉基因植物能耐高濃度TNT、吸收更多量的TNT，并將其有效降解，對含高濃度TNT的水或土壤有更強的適應性。目前，利用轉基因植物修復TNT的技術還處于實驗室階段，溫室和大田實驗還需要進一步研究。

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