外周血淋巴細胞替代肺癌細胞體外藥敏實驗的相關性研究

段國辰 杜錦波 牛占叢

化療在非小細胞肺癌治療中占有重要地位。常用的化療方案來源于多地區，大樣本的臨床統計資料。但部分具有相同病理類型患者對同一化療方案卻顯示不一樣的療效。如何選擇化療藥物，實現肺癌患者的個體化治療，提高療效，已經成為國內外學者的研究熱點。有文獻報道:多種器官惡性腫瘤的原代細胞培養及其藥敏實驗可以作為個體化化療的理論指導［1，2］。研究證實，不同個體之間對藥物的敏感性與其遺傳因素有著很大的關系。外周靜脈血淋巴細胞與實體瘤細胞同樣具有耐藥基因的表達［3］。有文獻報道MTT法檢測自身外周血淋巴細胞和患者癌細胞對同一化療藥物的敏感性存在良好的正相關性［4］。然而其相關性在肺癌方面的研究甚少。本實驗采用MTT法測定60例自身外周血淋巴細胞及其肺癌細胞對常用的4種化療藥物的敏感性，探討兩者的相關性旨在用外周血淋巴細胞替代肺癌細胞進行化療藥敏檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年03月至2011年09月我院收治的60例肺癌手術標本，且術前均未接受放療及化療治療。其中鱗癌34例，腺癌26例。根據UICC(1997)的分期標準:Ⅰb期10例，Ⅱ期30例，Ⅲa期20例。切除的腫瘤組織，均有病理學診斷。

1.2 方法 在手術室無菌條件下，取約黃豆大小的腫瘤組織，經大量0.9%氯化鈉溶液充分沖洗后置于含有雙抗的RPMI-1640培養液的標本瓶中，立即送檢。所有患者于術中切除肺癌組織后抽取外周靜脈血2 ml置于EDTA管中。

1.2.1 肺癌細胞單細胞懸液制作方法:①取小塊約黃豆大小的新鮮腫瘤組織用500 ml 0.9%氯化鈉溶液充分洗凈去除表面的血細胞后立即浸入含有雙抗的RPMI-1640培養液的無菌小瓶中，立即送往實驗室。②將取下的腫瘤組織放入培養皿中，用RPMI-1640液沖洗后再用眼科剪去除組織表面的臟層胸膜，及非腫瘤組織。再將腫瘤組織用眼科剪剪成肉末狀。③加入0.5 ml胰酶消化液放入37℃恒溫箱中培養15 min。④取出消化好的腫瘤組織，加入10 ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640液終止消化。⑤將此腫瘤細胞液經200目的鋼網過濾，再反復吹打，即可得到單細胞腫瘤液。⑥使用臺盼藍染色法計數，最終調整細胞數為(1～2)×105/ml。

1.2.2 淋巴細胞單細胞懸液制作方法:①在無菌條件下，將外周靜脈血2 ml加入10 ml的離心管中，再緩慢加入2 ml的人淋巴細胞分離液，2 000 r/min離心30 min。②分離出位于中層的白色細胞層即為外周血淋巴細胞層，用pbs液洗滌2次，棄去上清液。③用含10%胎牛血清的RPMI-1640液配制成單個細胞懸液。④使用臺盼藍染色法計數，最終調整細胞數為(1～2)×105/ml。

1.3 分組加藥 (1)加藥組:肺癌細胞或淋巴細胞單細胞懸液100μl/孔，化療藥10μl/孔，含10%胎牛血清的RPMI-1640液90μl/孔。(2)陰性對照組:肺癌細胞或淋巴細胞單細胞懸液100μl/孔，含10%胎牛血清的 RPMI-1640液100μl/孔。(3)空白對照組:含10%胎牛血清的RPMI-1640液200μl/孔。每組10個復孔，加藥后經震蕩充分混勻，將96孔板置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養48 h。(4)培養44 h后將 MTT試劑20μl/孔分別加入96孔板中，繼續培養4 h。從37℃、5%CO2恒溫箱中取出96孔板，每孔吸去上清液200μl，再將每孔加入DMSO 100μl，再將96孔板放置于震蕩器震蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶標儀(波長為490 nm)測每孔的OD值，據相對抑制率來判斷藥物敏感性。(5)計算公式如下相對抑制率=(1-加藥孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%。

1.4 判定標準 高度敏感為相對抑制率≥50%;敏感為相對抑制率≥30%;耐藥為相對抑制率＜30%［5］。

1.5 統計學分析應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，兩兩比較采用χ2檢驗，相關性分析采用直線相關，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 同一種化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環磷酰胺對患者肺癌細胞和自身外周血淋巴細胞的抑制率之間具有良好的正相關性。相關系數分別為:0.701、0.668、0.543、0.696，且有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 60例肺癌患者腫瘤細胞及自身外周血淋巴細胞對4種化療藥物敏感性的相關性比較n=60，±s

表1 60例肺癌患者腫瘤細胞及自身外周血淋巴細胞對4種化療藥物敏感性的相關性比較n=60，±s

藥物 腫瘤細胞 淋巴細胞 相關系數 P值CBDCA 34.51±7.20 26.48±5.51 0.701 0.000 VCR 29.04±5.41 21.04±4.75 0.668 0.000 5-Fu 31.40±4.84 22.73±3.47 0.543 0.000 CTX 26.05±3.32 16.85±3.27 0.696 0.000

2.2 根據60例肺癌細胞和自身外周血淋巴細胞對化療藥物的敏感率(敏感率=敏感病例數/病歷總數×100%)來分析:患者肺癌細胞和自身外周血淋巴細胞對相同化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環磷酰胺的敏感率無顯著性差異，χ2值分別為 0.786、1.645、0.263、0.261，且均無統計學意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 60例肺癌患者腫瘤細胞及自身淋巴細胞對4種化療藥物的敏感率比較 n=60，例

3 討論

到21世紀初，在癌癥死亡原因中，患肺癌的死亡率已由20世紀70年代的第4位躍居到第一位。肺癌的治療包括手術治療、放射治療、化學治療和生物治療。其中化療可殺死血液里的腫瘤細胞作為全身治療已成為腫瘤治療的不可替代的方法。目前在臨床使用的抗癌藥物均有不同程度的毒副作用，這是由于抗癌藥物對腫瘤細胞的選擇性不佳，導致化療失敗。所以針對個體化的化學治療逐漸成為研究的重點。MTT法被廣泛用于腫瘤細胞的抗癌藥物敏感實驗，為個體化化學治療提供了實驗基礎［6，7］，很大程度上避免耐藥性的發生，因此也減少了用藥的盲目性，同時在很大程度上減少了腫瘤的復發和遠處轉移，提高了五年生存率［8］。

臨床經常遇到以下問題:大多數肺癌患者一經發現就屬晚期，失去手術機會;或由于各種原因無法得到足夠量的肺癌組織標本;多次化療的肺癌患者效果差疑似藥物敏感譜發生改變;如何進行個體化化療。針對上述因標本來源問題無法進行肺癌細胞體外藥敏實驗的患者來說，能否利用外周血淋巴細胞培養進行化療藥物敏感實驗來代替腫瘤細胞對化療藥物的敏感性已成為目前研究的熱點。白細胞數為患者能接受化學治療的重要參考指標。在臨床工作中肺癌患者接受化療的同時，自身白細胞也會有一定程度的降低，這一現象說明化療藥物不僅能殺傷腫瘤細胞，同時也能殺死外周血淋巴細胞。我們通過基因組計劃的順利完成得知同一個體的正常體細胞與腫瘤細胞在基因組上是完全相同的。目前已經有大量研究表明，腫瘤細胞與外周血淋巴細胞攜帶有大量的同源基因，均具有耐藥基因表達［9］。本實驗顯示:肺癌患者腫瘤細胞及其自身外周血淋巴細胞對同一種化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環磷酰胺的敏感性是基本一致的。由表2可知肺癌細胞及自身外周血淋巴細胞對同一化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環磷酰胺的敏感性具有良好的正相關性。相關系數分別為:0.701、0.668、0.543、0.696，且均具有統計學意義。本結果表明肺癌細胞和自身外周血淋巴細胞對相同化療藥物卡鉑、長春新堿、五氟尿嘧啶、環磷酰胺的敏感率無顯著性差異，χ2值分別為0.786、1.645、0.263、0.261，且均無統計學意義(P ＞ 0.05)。由此結果提示:肺癌患者外周血淋巴細胞替代腫瘤細胞進行體外藥敏實驗是可行的。所以當患者已經失去手術機會，無法獲得肺癌組織標本及病理類型或者隨著化療次數的增加，腫瘤細胞的藥物敏感性可能會有所改變，因無法取得腫瘤組織標本進行藥敏檢測，此時應用外周血淋巴細胞來替代肺癌細胞進行藥敏實驗則更具有臨床意義。

肺癌原代細胞培養的藥敏試驗為肺癌患者篩選合適的化療藥物具有重要的意義，同時很大程度上避免了用藥的盲目性。為肺癌的個體化化學治療提供了思路。同時可以減輕不必要的藥物浪費，提高療效。淋巴細胞代替肺癌細胞進行藥敏試驗來選擇化療藥物是可行的。這樣便可以解決以下問題:(1)患者已經失去手術機會，無法獲得肺癌組織標本及病理類型。(2)腫瘤細胞難以純化、非腫瘤成分多容易干擾藥敏結果。(3)腫瘤組織污染較重，明顯影響藥敏結果。(4)多次化療的肺癌患者效果差疑似耐藥。

本研究以MTT法為手段檢測了60例自身外周血淋巴細胞及肺癌細胞體外的藥物敏感性。結果顯示:同一化療藥物對同一例肺癌患者的外周血淋巴細胞和肺癌細胞的抑制率具有良好的正相關性。另外，體內和體外對藥物的代謝動力學存在差異，應進行長期的體外藥敏實驗指導臨床患者的化學治療，進一步驗證體外藥敏實驗指導臨床化療的可行性，為肺癌患者的個體化治療提供更多的實驗依據。

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5 Xu JM，Song ST，Tang ZM，et al.Evaluation of in vitro chemosensitivity of antitumor drugs using the MTT assay in fresh human breast cancer.Breast?Cancer Res Treat，1998，49:251-259.

6 Kubota T，Egawa T，Otani Y，et al.Cancer chemotherapy chemosensitivity testing is useful in evaluating the appropriate adjuvant cancer chemotherapy for stagesⅢ/Ⅳ gastric cancers without peritoneal dissemination.Anticancer Res，2003，23:583-587.

7 張鳳梅，李勝水，許華，等.體外MTT藥敏試驗在指導原發性肝癌化療中的作用.醫學研究雜志，2009，38:68-69.

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