金柑抗凍實驗模型的建立

郭 純 ，楊 華 ，饒力群 ，李夢蕓，馬珊珊

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.湖南洞庭藥業股份有限公司，湖南 常德 415001）

凍害是農業氣象災害的一種。常發生的有越冬作物凍害、果樹凍害和經濟林木凍害等[1-3]。凍害對農業威脅很大，如美國的柑橘生產、中國的冬小麥和柑橘生產常因凍害而遭受巨大損失。歷史上，我國長江流域、美國柑橘產區就因嚴重的周期性凍害數次遭受嚴重打擊。自1949年以來，我國出現了5次柑橘大凍害（1955年，1969年，1977年，1992年和2008年），僅1992年1月的凍害使我國柑橘受凍面積達56萬hm2，產量損失超過200萬t；2008年1～2月的冰凍對幾個主要產區均造成嚴重影響，特別是湖南、湖北等地更為嚴重。湖北的三峽庫區、丹江庫區、富水庫區等柑橘集中產區75%以上的柑橘受到不同程度的凍害，其中有25%的柑橘受到毀滅性損害。湘西的柑橘產業也遭到了毀滅性打擊，受災面積達6.67萬hm2，成災4.73萬hm2，絕收近1.93萬hm2，直接經濟損失約7億元。面對如此頻繁的災害影響，研究柑橘抗凍的機制顯得十分必要，而建立柑橘抗凍試驗模型則是研究柑橘抗凍機制的前提條件。試驗采用冷馴化誘發抗寒能力的金柑為實驗組[4]，以未冷馴化誘發抗寒能力的金柑為對照組，模擬柑橘越冬時氣溫低、土溫高的環境[5-6]，摸索金柑能耐受的最低溫度和低溫持續時間，以建立金柑抗凍實驗模型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

挑選生長健壯、粗細較一致的2 a生金柑（Fortunella margarita(Lour.)Swingle）苗 200株，用缽高24 cm、缽開口直徑為24 cm規格的營養缽栽植，營養土為菜園土摻1/3的火土灰，采用一般的肥水管理和病蟲害防治。所有材料放置室溫28℃（室內溫度變動26.5℃～29.5℃。）正常生長1個月后，隨機選取100株移入控溫室內進行冷馴化，溫度設定為4℃，室內溫度為3.5～6.0℃，時間15 d。

1.2 低溫處理

試驗材料在冷馴化半個月后，每3株用棉絮包裹營養袋及根頸，放入試驗改裝的控溫箱進行低溫處理。控溫箱溫度在0～-20℃（溫度變化控制在±0.2℃）。以未冷馴化的金柑經過不同時間不同溫度的低溫處理后作為對照，取樣進行生理生化分析，單株設3次重復。

1.3 細胞損傷分析

金柑受凍的葉片表現為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質感變薄，葉片上的細小白點消失，數小時后逐漸卷曲，2~3 d后葉片干枯。以成熟葉片是否凍死（處理后葉片卷曲、干枯）為標準，配合電解質滲出率及丙二醛（MDA）含量的測定，找到金柑在試驗條件下所能耐受的最低溫度及能耐受低溫的持續時間。

1.3.1 電解質滲出率的測定 經低溫處理的材料分別放入20 mL具塞刻度試管中，準確加入去離子水20 mL，蓋上試管塞，在控溫室浸泡24 h，每次浸泡時保持環境溫度基本一致，攪動混勻后用精密電導率儀（DDS-312型，上海大普儀器有限公司）測定溶液電導率，冷馴化處理樣品的電導率為E1，對照材料的電導率為E0。冷馴化處理的樣品再放入98±2℃沸水浴中1 h，以殺死植物組織，取出置控溫室冷卻至室溫，測其煮沸電導率E2，按下式計算各處理的電解質滲出率：電解質滲出率（%）=[（E1-E0）/（E2-E0）]×100%。

1.3.2 丙二醛（MD A）含量的測定 取待測液1.0 mL，加入 5.0 mL 20%的三氯乙酸（TCA）（含 0.5%的硫代巴比妥酸：TBA）混勻后塞上塞子，水浴煮沸30 min，冰浴快速冷卻，4 000 r/min 離心 10 min，以20%TCA為參照，上清液用紫外分光光度計測定532 nm和600 nm處的吸光值A532和A600，重復3次求平均值，MDA含量=△A×N/W。△A=A532-A600，N為稀釋倍數，W為植物樣品重量（g）。

2 結果與分析

2.1 實驗模型的冰凍處理時間

為了探討金柑生長期所能耐受的冰凍低溫持續時間，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在-6℃下處理不同時間，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗冰凍30 min均未表現出凍害癥狀；未經冷馴化的金柑冰凍40 min出現凍害癥狀，60 min其大多數葉片受凍；而經冷馴化的金柑冰凍50 min才出現凍害癥狀，60 min只是輕微的凍害（表1）。為減少控溫箱中缺乏光照的影響，并鑒于上述結果，選定抗凍實驗模型的冰凍處理時間為60 min。

表1 -6℃下不同時間處理金柑葉片受凍情況

2.2 實驗模型的冰凍處理溫度

為了探討金柑生長期所能耐受的致死溫度，兩種處理的盆栽苗用棉絮包蔸，在不同溫度下冰凍處理60 min，觀察葉片受凍情況。兩種處理的盆栽苗0℃下均未表現出凍害癥狀；未經冷馴化的金柑-3℃出現凍害癥狀、-6℃大多數葉片受凍、-12℃全部葉片受凍；而經冷馴化的金柑-6℃才出現輕微的凍害癥狀、-12℃大多數葉片受凍（表2）。考慮到抗凍實驗模型中未經冷馴化的對照組要求表現受凍，而經冷馴化的處理組不能表現受凍，因此抗凍實驗模型的冰凍溫度需要選定在-9～-12℃。

2.3 低溫脅迫對金柑葉片電解質滲出率的影響

表2 不同低溫處理60 min金柑葉片受凍情況

兩種預處理的金柑在溫度高于-6℃條件下冰凍60 min，其葉片電解質滲出率均低于50%；但未經過冷馴化的金柑在-9℃條件下冰凍處理，其葉片電解質滲出率增加到58.4%，當溫度下降到-12℃時，電解質滲出率陡然增加到96.2%，表現為所有葉片均嚴重受損；而經過冷馴化的金柑葉片電解質滲出率在-9℃條件下依然低于50%，當溫度下降到-12℃時，電解質滲出率平緩地增加到51.4%，表現為部分葉片受損（圖1）。將溫度-電解質滲出率擬合Logistic方程[7-8]，可以求出半致死溫度。實驗結果表明經冷馴化的金柑的半致死溫度低于-10℃。當溫度處于-10℃時，未經冷馴化的對照組受凍60 min，其葉片的電解質滲出率遠大于50%，表現出嚴重的凍害，可以作為抗凍實驗模型的對照組；當溫度處于-10℃時，經冷馴化的實驗組受凍60 min，其葉片的電解質滲出率低于50%，不會表現出嚴重的凍害，可以作為抗凍實驗模型的實驗組。

2.4 低溫脅迫對金柑葉片中丙二醛（MDA）含量的影響

MDA是膜質受氧自由基破壞的產物，是膜損傷的重要指示指標。隨著溫度的降低，凍害加深，MDA含量也逐步增加。到-9℃時處理60 min出現峰值，但到-12℃時MDA含量反而急劇降低。對照組在-12℃時處理60 min的MDA含量較-9℃時處理60 min的MDA含量下降了0.062 6，處理組下降了 0.084 6（圖 2）。

2.5 抗凍實驗模型的檢驗

圖2 不同冰凍溫度處理下金柑葉片MDA含量的變化

根據對不同溫度和不同處理時間的研究，選定處理溫度為-9～-12℃之間，處理時間為60 min。再通過考察金柑葉片電解質滲出率和MDA含量，選定處理溫度為-10℃。對照組和冷馴化組金柑經過-10℃條件下冰凍60 min處理，結果如圖3。研究結果表明：未經冷馴化的對照組在-10℃條件下冰凍60 min后受到嚴重凍傷。葉片表現為水漬狀、透明，顏色加深呈墨綠色，質感變薄，葉片上的細小白點消失，1 h后逐漸卷曲，2~3 d干枯，樹枝變軟、下垂，逐步變黃，數日后干枯，最后整株死亡；經過冷馴化的處理組在-10℃條件下冰凍60 min后受到一定的凍害。葉片呈輕微水漬狀，顏色加深呈淺綠色，葉片上的部分細小白點消失，少部分嫩葉微卷曲；嫩枝變軟，葉片下垂；經過28℃恢復1星期，葉色變淺，葉片背面呈白色，細小白點重新出現，嫩枝變硬，葉片抬升；并有少數腋芽萌動。由此表明：在-10℃條件下冰凍60 min，對照組受到嚴重凍害，而處理組只有輕微凍害并能得到恢復。因此，-10℃可以作為抗凍實驗模型的處理溫度。

圖3 -10℃條件下60 min冰凍處理金柑葉片受凍情況

3 討論

3.1 材料的選擇

柑橘的耐寒性與柑橘品種密切相關，柑橘品種的耐寒能力依次為：枳>金柑>闊皮柑橘>酸橙>甜橙>柚類>檸檬、枸櫞[9-10]。枳耐寒能力最強，但枳到冬天葉片會脫落，無法用其葉片開展抗凍研究[11]。金柑，又名金桔，屬蕓香科，是著名的觀果植物。金柑雖然抗寒能力弱于枳，但其屬常綠植物，而且葉形較大，取材方便，是開展柑橘抗凍研究的理想材料。

3.2 金柑根系的保護

柑橘根系不耐低溫，在自然條件下，柑橘越冬時氣溫雖然低，但根際土壤的溫度仍較高，使根系不受低溫影響。但在實驗時，由于盆栽苗土壤少，冰凍處理時無法維持較高溫度，柑橘根系受損，影響抗凍實驗模型的建立。因此，試驗采用棉絮包裹營養缽及根頸的辦法保護金柑根系。

3.3 處理時間和溫度的選擇

試驗結果表明，冰凍處理時間60 min的效果和70 min的效果相當。由于控溫箱中缺乏光照，時間過長，金柑將受到影響，因此選定處理時間為60 min。

柑橘凍害的氣象指標，按凍害的發生程度可分為-5℃、-7℃、-9℃、-11℃等 4個溫度等級，分別代表柑橘開始受凍害、輕凍害、凍害和重凍害的指標。但以往的研究表明，冷凍室冰凍處理與自然界冰凍有差異。因此，根據前期的研究，將溫度設置為0℃、-3℃、-6℃、-9℃和-12℃。

3.4 金柑抗凍實驗模型

以冷馴化后冰凍處理未表現凍害的金柑為抗凍組，以未冷馴化后冰凍處理表現凍害的金柑為對照組建立金柑抗凍實驗模型。研究結果表明：金柑在-10℃條件下冰凍60 min后，對照組受到嚴重凍害，而經過冷馴化的處理組只有輕微凍害并能得到恢復。因此，-10℃可作為抗凍實驗模型的處理溫度。

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