白藜蘆醇對糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體中P53表達(dá)的影響

帥天姣，張 劍，張 滌，王冬蘭

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江佳木斯154003)

隨著生活水平和質(zhì)量的提高，糖尿病以漸入國人的生活，其并發(fā)癥常常困擾著國人的健康，其眼科并發(fā)癥越來越受重視[1]。糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)是糖尿病眼病的主要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致成人致盲的原因之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell，LEC)凋亡在疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]，同時(shí)，氧化性損傷也是重要成因[3]。白藜蘆醇是一類非黃酮類多酚化合物，具有強(qiáng)大抗氧化、清除氧自由基以及抗凋亡能力[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究白藜蘆醇對STZ(鏈脲佐菌素)誘導(dǎo)糖尿病性白內(nèi)障大鼠LEC有無作用及對其晶狀體中P53表達(dá)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供更科學(xué)的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

白藜蘆醇和STZ均購自Sigma公司(純度分別＞99%和＞98%)，P53一抗、二抗及顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司，PBS緩沖液、梯度酒精、4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液、二甲苯、防脫劑等生化試劑均自上海生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理:Wistar大鼠80只(由長春億斯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量(160±20)g，經(jīng)散瞳實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果顯示晶狀體均正常透明，隨機(jī)分為4組:A正常對照組、B糖尿病模型組、C白藜蘆醇低劑量治療組及D白藜蘆醇高劑量治療組，每組各20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，糖尿病模型組在禁食8h后一次性腹腔注射STZ(溶于新鮮配制的 0.1mol/L的檸檬酸緩沖液，pH 4.5)60mg·kg－1，正常對照組以等量檸檬酸緩沖液腹腔注射，72h后鼠尾靜脈采血測定空腹血糖，以血糖≥16.7mmol/L確定為糖尿病模型組。白藜蘆醇高劑量治療組及白藜蘆醇低劑量治療組在糖尿病模型組基礎(chǔ)上每日固定時(shí)間分別以白藜蘆醇混懸液100mg·kg－1·d－1、20mg·kg－1·d－1體質(zhì)量灌胃，正常對照組及糖尿病模型組均給予含0.02mL/mL DMSO的生理鹽水灌胃，分別于4w、8w、12w裂隙燈下觀察各組大鼠晶狀體混濁程度并予以記錄，并于末次給藥后次日采用10%水合氯醛麻醉并在無菌條件下處死大鼠，4℃ 取晶狀體，采用石蠟包埋組織化學(xué)技術(shù)，對各組切片行P53免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其在4組晶狀體中的表達(dá)情況。

1.2.2 晶狀體混濁程度的觀察:大鼠經(jīng)1%托品卡胺滴眼液滴雙眼一次，5min后使大鼠吸入乙醚蒸汽麻醉，裂隙燈下觀察各組大鼠晶狀體變化情況。晶狀體混濁程度根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級:I級，無混濁，晶狀體清亮透明;II級，輕度混濁，晶狀體周邊有少量空泡;III中度混濁，空泡擴(kuò)散至中心區(qū)域，晶狀體核出現(xiàn)霧狀混濁;IV級，晶狀體高度混濁，周邊空泡擴(kuò)展到核區(qū)，核霧狀混濁進(jìn)一步加重;V級，核混濁，完全性白內(nèi)障。

1.3 檢測方法

免疫組織化學(xué)SP法測定大鼠LEC中P53蛋白的表達(dá)，各組晶狀體取出后放入10%甲醛溶液中，4℃冰箱固定24～48h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，染色，DAB顯色，輕度復(fù)染，常規(guī)封片。

1.4 結(jié)果判定

P53陽性細(xì)胞為胞漿呈棕黃色，表達(dá)結(jié)果以高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)及陽性率，按切片中陽性細(xì)胞數(shù)百分比例劃為4個(gè)等級[6]:0%～5%:(—);5%～10%:(+);20%～35%(?);35%～50%(?)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 晶狀體混濁度觀察

12w后正常對照組大鼠晶狀體清亮透明;糖尿病模型組大鼠晶狀體 I級、II級、III級、IV級和 V級改變分別為3.0%、17.0%、53.0%、13.7%和 10.0%;白藜蘆醇低劑量組大鼠晶狀體 I級、II級、III級、IV級和 V級改變分別為47.3%、38.2%、14.5%、0% 和 0%;白藜蘆醇高劑量組大鼠晶狀體I級、II級、III級、IV級和V級改變分別為65.6%、20.3%、14.1%、0.0%和 0.0%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，糖尿病組大鼠晶狀體混濁度分別與白藜蘆醇高、低劑量治療組大鼠晶狀體混濁度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 白藜蘆醇對P53的影響

免疫組織化學(xué)染色示，P53在正常晶狀體上皮細(xì)胞中幾乎無蛋白表達(dá)，其陽性細(xì)胞表達(dá)率＜0.01%(圖1)，P53在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體中蛋白高表達(dá)(圖2)，在白藜蘆醇低劑量治療組(圖3)中表達(dá)高于白藜蘆醇高劑量組治療組(圖4)，見表1。

表1 各組LEC中P53蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分率(±s，%，n=6)

表1 各組LEC中P53蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞百分率(±s，%，n=6)

組別4w 8w 12w A ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 B 26.65±0.47 28.87±0.21 30.64±0.91 C 25.16±0.23 23.28±0.46 21.11±0.31 D 24.93±0.22 18.10±0.17 13.35±0.32

圖1 P53在A組晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)(12w)

圖2 P53在B組晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)(12w)

圖4 P53在D組晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)(12w)

LEC中P53蛋白表達(dá)分析結(jié)果:正常對照組＜0.01%;P53蛋白表達(dá)在糖尿病模型組中高于白藜蘆醇治療組，其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);4w時(shí)白藜蘆醇高、低劑量治療組二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明白藜蘆醇在用藥4w時(shí)未起到治療作用，8w時(shí)其二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但差異不顯著，12w時(shí)二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，差異顯著，說明白藜蘆醇在治療12w后開始出現(xiàn)明顯療效，且高劑量治療效果顯著大于低劑量治療效果。

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract，DC)是糖尿病眼病的主要并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致成人致盲的原因之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來研究者開始在基因?qū)用鎽?yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)探討與研究糖尿病性白內(nèi)障多元醇通路與氧化應(yīng)力二者的關(guān)系[7]，以說明氧化損傷與晶狀體抗氧化防御系統(tǒng)的紊亂在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生和進(jìn)展中起著重要作用，對慢性糖尿病白內(nèi)障的發(fā)展至關(guān)重要。正常晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)幾乎無凋亡細(xì)胞，而白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中可見大量的凋亡細(xì)胞，因此其細(xì)胞的凋亡可能是各種非先天性白內(nèi)障發(fā)生與發(fā)展的共同細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡是指基因控制下的細(xì)胞死亡，研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有20余種基因與其有關(guān)[8]，按基因表達(dá)產(chǎn)物對凋亡過程的作用分為兩類，一類是促進(jìn)凋亡的基因，如P53、Bcl－xs等，另一類是抑制凋亡的基因，如NF－KB、Bcl－2等。本實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)糖尿病模型組大鼠LEC凋亡率明顯高于正常對照組，再次證實(shí)了糖尿病性白內(nèi)障大鼠LEC凋亡是引起白內(nèi)障的重要因素。而白藜蘆醇處理的大鼠，LEC凋亡率明顯低于糖尿病模型組，說明了白藜蘆醇在一定程度上抑制或延緩了晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。P53是一種抑癌基因，其有野生型和突變型兩類，如果細(xì)胞DNA修復(fù)失敗，P53蛋白持續(xù)升高，便可引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)在正常晶狀體中未見P53蛋白表達(dá)，在糖尿病模型組中可見陽性細(xì)胞，揭示了P53基因促進(jìn)了LEC的凋亡，導(dǎo)致了晶狀體的混濁。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法觀察大鼠LEC，證實(shí)了當(dāng)有危險(xiǎn)因素存在時(shí)，可導(dǎo)致LEC的氧化損傷，而使其DNA收到損傷，激活P53基因，導(dǎo)致LEC出現(xiàn)凋亡，最終會(huì)晶狀體混濁。同時(shí)通過觀察白藜蘆醇的治療后的大鼠LEC，得出白藜蘆醇對糖尿病性白內(nèi)障大鼠LEC的凋亡有一定的抑制作用，且其高劑量治療效果明顯優(yōu)于低劑量治療效果，從而進(jìn)一步證明白藜蘆醇能在一定程度上抑制或延緩了糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)生。

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