不同溶解液對CYP1B1432密碼子PCR引物穩定性的影響

國玉芝，荊洪英，張志國，田 寅

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154003)

引物是所有聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaetion，PCR)中必須使用的主要材料之一，引物的穩定性對PCR的結果有著重要影響，可以說是決定PCR成敗的關鍵因素，而不同的引物溶解溶液對引物的穩定性有著重要影響，我們在進行CYP1B1432密碼子(rs1056836)的PCR中就遇到了該問題。對于引物的穩定性，多數文獻[1，2]從引物長度，解鏈溫度(Tm)引物序列，引物二聚體及引物自由能等方面考慮，而沒有見到關于引物溶解溶液對于引物穩定性的報道，因而我們使用常用的引物溶解溶液滅菌雙蒸水，滅菌去離子水和10mM三羥甲基氨基甲烷－乙二胺四乙酸緩沖液(Tris－EDTA，TE)溶解引物，通過PCR后電泳條帶的亮度與脫氧核糖核酸梯狀標志(DNA Ladder Marker)亮度的比較確定PCR效果，并將PCR產物進行了電泳和酶切后電泳的方法考察了引物的穩定性，結果表明使用去離子水和TE作為引物的溶解溶液較好，而使用滅菌雙蒸水效果較差。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國 Bio－Rad公司);PowerPac Universal通用型電泳儀(美國 Bio－Rad公司);ChemiDoc XRS凝膠成像系統(美國Bio－Rad公司);H2500R－2高速冷凍離心機(上海滬譽貿易有限公司)。

1.1.2 試藥

Genomic DNA Purification Kit、Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)、Gene Ruler 100 bp DNA Ladder，Oli I內切酶，Fermentas公司生產;Gelred染色劑由BIOTIUM公司生產;CYP1B1432密碼子PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;滅菌雙蒸水，天津藥業集團新鄭股份有限公司生產，滅菌去離子水由本院制劑室生產;TE自行配制。

1.2 方法

1.2.1 引物配制及試驗方法

參考有關文獻[3]使用引物序列為Forward Primer:5＇……ATGCGCTTCTCCAGCTTTGT……3 ＇，Reverse Primer:5 ＇……TATGGAGCACACCTCACCTG……3＇，PCR 產物長度 623bp。取F、R引物各6支，每支1.0 OD，分為3組，每組上下引物各兩支，第1組使用滅菌雙蒸水(pH6.0);第2組使用滅菌去離子水(pH7.5);第3組使用 TE(pH7.5)溶解配制成100μmol·L－1的引物，置－20℃冰箱保存;次日每組各取1支室溫下融化，使用相應的溶解液稀釋成10μmol·L－1的引物，每組引物分裝為4支，置－20℃冰箱保存，分別于第1～4周的周一開始連續5d進行PCR試驗;100μmol·L－1引物分別于第2、第4、第6和第8個月取適量使用相應的溶劑稀釋成10μmol·L－1并于每月的第一天連續做5d PCR試驗。

1.2.2 PCR、酶切及電泳

PCR體系為Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，ddH2O 8.5μL，F、R primer各 1.0μL，血液 DNA 2.0μL。PCR條件為95℃預變性及酶激活4min;95℃變性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，共 35 個循環;72℃ 末延伸5min。酶切體系為 10 ×green buffer 2μL，Oli I內切酶 1μL，ddH2O 17μL，PCR 產物 10μL;酶切條件:水浴 37℃ 酶切10min，然后取出立即置水浴65℃滅活5min。使用經Gelred染色的2%瓊脂糖凝膠電泳45min，電壓145V。電泳結束把凝膠從膠板上取出，放到凝膠成像系統中觀察結果并拍照。

2 結果

分別取引物按2.1項的時間和2.2 PCR體系與方法進行PCR，100bp DNA Ladder與 PCR產物分別點樣5μL，酶切產物點樣8μL進行電泳。結果判斷:當PCR產物亮度大于或等于600bp Ladder時，判定陽性(+);當亮度小于600bp Ladder或條帶顯示不清時，判定為陰性(－)(此時酶切后可能會無法顯色)。PCR及酶切產物典型電泳圖如圖1，10μmol·L－1和 100μmol·L－1引物 PCR 產物電泳結果如表1、表2。

圖1 CYP1B1432密碼子PCR產物及酶切后典型電泳圖

表1 10μmol·L－1引物使用時間及PCR產物電泳結果

由表1的結果可見:雙蒸水溶解的10μmol·L－1引物第1周可以凍融5次，第2周可以凍融2次;第3周擴增電泳后沒有出現PCR產物條帶;去離子水和TE溶解的10μmol·L－1引物第1周和第2周可以凍融5次，第3周可以凍融4次，第4周尚可以凍融3次。

表2 100μmol·L－1引物稀釋使用時間及PCR產物電泳結果

由表2可見，雙蒸水配制的100μmol·L－1引物在－20℃保存兩個月時稀釋只能凍融2次，到第四個月時使用稀釋引物擴增電泳后沒有出現PCR產物條帶;去離子水和TE溶解的100μmol·L－1引物－20℃可以保存8個月，但在保存8個月時稀釋只可以凍融2次。

3 討論

在“生工生物工程(上海)股份有限公司”(引物合成單位)網站上(http://www.sangon.com/sangon_detail.aspx)如何溶解并保存引物項標注引物溶解使用滅菌雙蒸水或10mM TE緩沖液(pH 7.5～8.0)溶解。在實際工作中，溶解引物的溶劑有滅菌雙蒸水、滅菌去離子水、TE緩沖液等。本文使用的溶解溶劑經過pH值檢測，滅菌雙蒸水pH值為6.0，滅菌去離子水和TE緩沖液pH值為7.5。本文試驗中表明使用滅菌雙蒸水溶解的 10μmol·L－1和 100μmol·L－1引物 PCR效果不好，其原因可能是和其pH值較低有關，引物雖然是小分子單鏈DNA，但其同樣具有DNA的性質，DNA在弱酸性條件下不如在弱堿性條件下穩定，在弱酸性條件下很快降解了，所以PCR效果不如其他兩種溶劑溶解的引物PCR效果好。使用滅菌去離子水和TE緩沖液作為溶解液較好，其新溶解的10μmol·L－1引物工作液可以耐受1周內的5次和2周內的5次凍融;在4周和5周時尚可以耐受4次和3次凍融試驗，在保存2周后，耐受凍融次數明顯減少，所以，10μmol·L－1引物保存時間最好不要超過2周。使用滅菌去離子水和TE配制的100μmol·L－1在－20℃保存4個月時稀釋，可以耐受5天內5次凍融，在保存6個月時稀釋，尚可耐受4次凍融，保存8個月時稀釋，可以耐受2次凍融試驗。為保證PCR效果，100μmol·L－1引物保存期以 －20℃6個月為好。由本實驗也可以得知，100μmol·L－1引物較 10μmol·L－1引物穩定，在－20℃保存期可以達到6個月。但由于TE緩沖液含有絡合劑EDTA，使用時會絡合PCR混合液中的Mg2+，其作為引物的溶解液應該嚴格控制其濃度，以避免影響PCR效果。為了證明引物穩定性試驗的可靠性，本文使用保存6個月的引物作了PCR試驗并進行酶切，結果三種基因型條帶顯示清楚，滅菌去離子水和TE配制的引物可以在PCR實踐中應用。

[1]李金明.實時熒光PCR技術[M].北京:人民軍醫出版社，2007，5-7

[2]靜國忠.基因工程及分子生物學基礎[M].北京:北京大學出版社，1999，195-198

[3]Trubicka J，Grabowska Klujszo E，Suchy J，et al.Variant alleles of the CYP1B1 gene are associated with colorectal cancer susceptibility[J].BMC Cancer，2010，10:420