AQP3在人非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

王鳳玲，張小霞，蔡棟梁

(佳木斯大學附屬第一醫院老年病科，黑龍江佳木斯154003)

近年來，肺癌在我國乃至全世界的發病率和死亡率已經躍居惡性腫瘤的首位，其中非小細胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數的85%，其5年生存率僅16%，嚴重威脅著人類的健康。然而由于肺癌早期癥狀表現不明顯，往往錯過最佳診斷和治療時機，發現時大部分已處于中晚期，失去了手術機會，因此改進肺癌的診治水平，提高患者的生存率，對改善患者預后和增加生存率具有重要意義。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組參與跨細胞膜轉運水的膜通道蛋白家族，根據其通透性的不同又分為水通道和水－甘油通道兩個亞族，AQP3屬于后者，通透水及其他小分子物質如甘油、尿素等，在液體穩態中發揮著重要作用。目前已有研究證實，AQP3在多種不同來源的腫瘤中表達水平較高，尤其是在侵襲性強的腫瘤中。但 AQP3在肺癌中的研究甚少，本課題采用免疫組織化學方法和酶聯免疫法(ELISA)檢測AQP3在非小細胞肺癌中的表達特性，探討其在肺癌發生、發展中的作用及其作為診斷和治療肺癌的新的分子靶點的潛在可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取2012－02～2013－06期間佳木斯大學附屬第一醫院收住的非小細胞肺癌手術患者術后組織標本和血清標本各42例為實驗組，20例癌旁組織(距癌腫超過5cm以上的正常肺組織)及20例健康體檢者血清為對照組。非小細胞肺癌患者男24例，女18例;年齡36～87歲，平均(63±11)歲;腺癌22例，鱗癌20例;TNM分期:I、II期26例，III期16例;組織病理類型:高、中分化19例，低分化23例。入選標準:所選患者均為首次手術且達到完全性切除并經病理學確診，術前均未接受放化療，1個月內未接受全身或局部激素治療，未應用過抗腫瘤藥物，排除合并有哮喘、肺囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病及不動纖毛綜合征等其他肺部疾病的患者。均經患者家屬知情同意。

1.2 主要試劑

兔抗人AQP3多克隆一抗，免疫組化染色試劑盒，人水通道蛋白－3 ELISA試劑盒，所需試劑均購自天津索羅門生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

①將待測標本統一切成4μm厚石蠟切片，其中每份標本備2張切片行常規HE染色及免疫組織化學染色。②NSCLC患者在手術治療前抽空腹靜脈自凝血2mL室溫靜置1h，離心(5000r/min)，分離血清，冷凍保存，集中用ELISA法測血清中AQP3的濃度。各步驟嚴格按照檢測試劑盒說明進行。

1.4 結果判定

①免疫組化SP法:由兩位有經驗的病理科醫師對染色結果進行評判。以細胞膜或(和)細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。參照Ozdemir等的評分標準，按染色強度和染色細胞百分數進行評分，其中染色強度評分標準:淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;染色細胞百分數評分標準:染色細胞＜1/3為1分、1/3～2/3為2分、＞2/3為3分。每張切片染色程度與染色細胞數得分相乘為其最后得分，得分＜1為陰性，1～3為弱陽性(+)，4～6為中陽性(++)，7～9為強陽性(+++);表達程度的劃分界限:(－)及(+)為陰性表達，(++)及(+++)為陽性表達。②免疫吸附實驗:根據AQP3的標準品濃度及其對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，再根據樣品的OD值計算出相應的的樣品濃度。

1.5 統計學處理

采用SPSS17.0統計軟件。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用兩樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

圖1 AQP3在鱗癌中的表達(SP×400)

圖2 AQP3在腺癌中的表達(SP×400)

2 結果

2.1 AQP3在非小細胞肺癌患者腫瘤組織中的表達

實驗組患者的腫瘤組織標本陽性表達30/42例，陽性率為71.43%，對照組陽性表達6/20例，陽性率為30%，兩者之間的差異具有顯著統計學意義(P＜0.05)。

2.2 AQP3在非小細胞肺癌患者血清中的表達

血清AQP3的表達在實驗組患者組為(3.53±1.39)ng/L，而對照組為(2.80±1.07)ng/L，實驗組表達量明顯高于對照組，兩組間差異具有顯著統計學意義(P＜0.05)。

2.3 AQP3在不同病理因素非小細胞肺癌患者的癌組織內和血清中的表達

AQP3在非小細胞肺癌組織中的表達水平與肺癌患者的性別、年齡、吸煙情況及 TNM分期均無明顯相關性(P＞0.05)，而AQP3在腺癌中的表達陽性率明顯高于鱗癌(P＜0.05)，中、高分化組的表達陽性率明顯低于低分化組(P＜0.05)，有淋巴結轉移組的表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移組(P＜0.05)，見表1。

表1 AQP3在肺癌患者癌組織中的表達與臨床病理因素的關系

AQP3在非小細胞肺癌患者血清中的表達水平與患者的性別、年齡、吸煙情況無相關性(P＞0.05)，而在腺癌中表達明顯高于鱗癌(P＜0.05)，在低分化組中表達高于中、高分化組(P ＜0.05)，臨床分期為III期組的表達高于I、II期(P＜0.05)，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組(P ＜0.05)，見表2。

表2 AQP3在肺癌患者血清中的表達與臨床病理因素的關系

3 討論

水通道蛋白是一組能介導水的快速跨膜轉運的膜通道蛋白，分子量約30kDa，屬于固有蛋白家族。該蛋白能增加細胞膜的通透性，參與水的分泌、吸收以及細胞內外平衡的調節。首次被人類認識的水通道蛋白是AQP1，是由Argre等鑒定人類Rh血型抗原時于紅細胞膜上偶然發現的。隨著研究的不斷進展，目前已發現的該家族成員已有13個，即AQP0～12，稱為水通道蛋白家族[1，2]。現對于呼吸道中AQPs的分布研究較明確的有 AQP1、3、4、5四種，其中 AQP3主要分布在氣管和支氣管的假復層上皮細胞基底膜以及部分肺泡Ⅱ型上皮細胞[3]。

惡性腫瘤細胞的快速生長、侵襲和轉移除了需要蛋白質、脂類等營養物質外，還需要大量快速跨膜轉運的水，近年來研究發現，AQP在腫瘤細胞的生長、血管生成、侵襲和轉移中起重要作用[4]。研究表明，水通道蛋白可能參與腫瘤細胞的發生、轉移過程[5]。有研究證實，AQP3在腫瘤細胞及腫瘤新生血管內皮細胞中均表達，提示AQP3參與腫瘤的血管生成[6]。推測AQP3表達的改變可能既影響了水分子的運輸，又影響了細胞的生命活動。本實驗通過兩種方法檢測了AQP3在肺癌中的表達情況，肺癌患者的癌組織和血清中AQP3的表達水平均顯著高于正常對照組，其中，腺癌患者、低分化患者及有淋巴結轉移患者肺癌組織中AQP3的表達水平分別高于鱗癌患者、中(高)分化患者及無淋巴結轉移患者。這表明在肺癌發生過程中，隨著惡性腫瘤細胞的增加，對水分子快速跨膜轉運的需求增多，進而AQP3的表達也隨之增加，由AQP3形成的水通道可能改變了癌變組織中細胞內的滲透壓，轉運了大量的小分子物質，加快了腫瘤細胞的快速增殖并向周圍基質浸潤，提示AQP3在肺癌發生、發展過程中可能起重要作用。另外，血清中AQP3水平上調是腫瘤發生過程的重要事件，也提示血清AQP3可作為肺癌診斷的輔助手段。在肺癌患者中，血清AQP3水平與TNM分期顯著相關，而在肺癌組織中AQP3表達水平與TNM分期的相關性無顯著的統計學意義，這種差異提示可能血液中AQP3的變化較組織中的變化更為敏感，也可因試驗方法不同所致，有待進一步研究證實，研究樣本量較少也可能造成這種差異。

綜上所述，AQP3可能與非小細胞肺癌的發生、發展密切相關，肺組織中及血清中AQP3表達水平的檢測可能作為NSCLC的輔助診斷指標，尤其是血清中AQP3水平的檢測具有相對無創、標本易得、可動態觀察等優點，值得進一步推廣。另外，本實驗還提示AQP3抑制劑有待開發。

[1]Damiano AE.Review:water channel proteins in the human placenta and fetal membranes[J].Placenta，2011，2:207-211

[2]Mariusz T，Skowronski，Agniesza，et al.Fluctuation of aquaporin 1，5，and 9 expression in the pig oviduct during the estrous CYCLE AND early pregnancy[J].Journal of Histochemistry ＆Cytochemistyr，2011，59:419-427

[3]Liu Y L，Matsuzaki T，Nakazawa T，et al.Expression of aquaporin 3(AQP3)in normal and neoplastic lung tissues[J].Human pathology，2007，38(1):171-178

[4]Bailing L I，Lei J I N，ZHONG K，et al.Correlation of Aquaporin 3 Expression with the Clinicopathologic Characteristics of Non－small Cell Lung Cancer[J].Chinese Journal of Lung Cancer，2012，15(7):404-408

[5]王培軍，原德新，韓淑云，等.水通道蛋白1和Survivin在卵巢癌組織中的表達及其臨床意義[J].黑龍江醫藥科學，2011，34(2):40-41

[6]Wang J，Gui Z，Deng L，et al.c－Met upregulates aquaporin 3 expression in human gastric carcinoma cells via the ERK signalling pathway[J].Cancer Lett，2012，319(1):109-117