丹參川穹嗪注射液治療膠原誘導性關節炎大鼠的實驗研究

王建峰

(攀鋼集團總醫院，四川攀枝花617023)

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種原因未明的，以對稱性地累及外周關節與持續性滑膜炎癥為主要表現的慢病程、多系統性免疫病。多數患者可以發展為病程遷延的多關節炎，伴有關節功能障礙，甚至出現關節外的系統性表現。微小血管的損害和滑膜細胞量增多被認為是類風濕關節炎滑膜炎的早期病理變化。病情發展后，滑膜水腫，絨毛形成。晚期，生成一些免疫球蛋白的多克隆自身抗體。這其中亦包含了各種趨化因子，受體及介質的相互影響及作用。丹參川芎嗪注射液是由丹參與鹽酸川芎組成的復方制劑。本復方制劑有擴張外周血管阻力，減低TXA2的水平，直接清除氧自由基，改善循環，減輕心臟負荷，降低血液黏滯度，改善微循環的作用。亦有減少內皮素的分泌，抑制免疫反應和免疫復合物的形成的作用。此次研究是應用丹參川穹嗪來治療膠原誘導性關節炎大鼠，觀察記錄其療效，并測定其血清中IL－1β、IL－6、TGF－β表達水平。觀測丹參川穹嗪在膠原誘導性大鼠中的治療效果，為丹參川穹嗪在臨床的應用提供一定的方向線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

60只清潔級Wistar大鼠，雌性，體重165～200g。卡介苗凍干粉(北京生物制品研究所)，牛Ⅱ型膠原(美國Sigma公司)，丹參川穹嗪注射液(吉林四長制藥有限公司)，IL－1β、IL－6及TGF－β酶聯免疫ELISA試劑盒(天津索羅門生物科技有限公司)。

1.2 方法

將牛Ⅱ型膠原蛋白與卡介苗及等體積量CFA充分乳化后，在隨機選取的45只大鼠背部與尾部皮下多點注射該乳化劑0.2mL，復制膠原誘導性關節炎大鼠(collagen－induced arthritis，CIA)模型，為了保證成功，于第7、14再次給予加強注射乳化劑，剩余的15只作為對照組，給予同等劑量的生理鹽水注射。將造模成功的45只大鼠隨機分為3組，分別是膠原性關節炎模型組、丹參川穹嗪治療組與地塞米松治療組。然后，在造模后第15天選取15只通過腹腔注射丹參川穹嗪，按20mg/kg的劑量給藥，連續給藥兩周，此為丹參川穹嗪組。再次選取15只使用地塞米松磷酸鈉注射液，按0.2mg/kg劑量腹腔注射給予，同理連續給藥2周。剩余15只模型組與15只對照組給予等量的生理鹽水處理。實驗完畢后所有大鼠斷頭處死，每只取血約5mL，離心機4000r/min，低溫離心10min，取上清液，最后保存于－20℃冰箱中待測。

1.3 統計學處理

采用統計學軟件包SPSS17.0，數據值采用均數±標準差(±s)來表示，兩組的比較采用t檢驗，以P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

模型大鼠血清中IL－1β、IL－6表達水平相較正常對照組有明顯升高(P＜0.05);治療組中丹參川穹嗪組較造模組有顯著降低(P＜0.05);其與地塞米松組無明顯差異，無統計學意義(P＞0.05)。

同樣的，模型組大鼠血清中TGF－β的水平較正常組是顯著下降(P＜0.05);治療組中丹參川穹嗪組比造模組有明顯升高(P＜0.05);其與地塞米松組無顯著差異(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL－1β、IL－6及TGF－β水平比較(±s，n=15)

表1 各組大鼠血清IL－1β、IL－6及TGF－β水平比較(±s，n=15)

注:*與對照組比較，P＜0.05，#與造模組比較，P＜0.05。

組別 TGF－β IL－1βIL－6正常對照組0.91±0.07 13.78±1.52 22.49±1.77模型組 0.40±0.08* 46.39±3.31* 38.13±7.97*丹參川穹嗪組 0.63±0.11*# 27.42±5.63*# 29.23±6.22#地塞米松組 0.68±0.15*# 23.27±4.96*# 25.29±8.66#

3 討論

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是表現為滑膜關節的慢性滲出性炎癥、增生為主要，進而侵蝕關節軟骨、骨膜、肌腱與韌帶等結締組織，終末期引起關節破壞畸形、關節功能的完全喪失的自身免疫性風濕性疾病。發病年齡多來自于中老年女性，患病率大約為0.32%～0.36%。隨著醫學基礎學和生物學技術的飛快發展，對于RA的病因、病理機制研究有了一些新的認識和進步。目前大多認為本病是源于多種抗原生物因子介導和參與的免疫紊亂性疾病，可能和遺傳、各種感染、環境生態的污染破壞、藥物激素水平以及精神心理狀態等因素存在密切關系。長久以來，病毒感染因素一直被懷疑為引起RA的主要因素。隨著時間的推移，新的觀點不斷提出，有研究發現類風濕關節炎患者的的免疫細胞的數量與功能方面都出現了較顯著地失衡表現。RA的發病患者中Th1/Th2細胞發生失衡，Th1及Th1因子占有明顯優勢，處在Th1型狀態中，通過分泌的大量細胞因子如IL－1β、TNF－α、IL－6、IFN －γ 等加重了炎癥反應和損傷;另外在RA患者血清和關節液中觀察到TGF－β增高，TGF－β對T細胞活化和增殖、B細胞分化具有特異的抑制作用。丹參川穹嗪注射液作為一種祖國醫學中醫藥方面的復方制劑，其方是通過科學合理的方法把鹽酸川穹嗪加丹參素配比提取的注射液。川穹嗪有活血化瘀的作用，其有效成分四甲基吡嗪鹽酸鹽可以保護血管內皮，具有調節免疫、收縮血管、平衡纖溶和凝血機制，抗血小板活性聚集等作用。丹參素有抑制黏附分子，改善微循環，抑制NO產生等功能。

轉化生長因子β(Transforming growth factor－β，TGF－β)該家族中眾多蛋白成員都被證明在許多疾病的生理、病理機制中承擔了重要的功能。在免疫系統的整體調節上，TGF－β發揮了很重要的作用。近來對動物的免疫實驗研究表明，TGF－β直接或間接地的調控了所有參與免疫系統的關聯細胞，幾乎所有白細胞的增殖、分化一系列生理和病理活動。TGF－β為炎癥免疫反應的負方向調控因子，在血漿中生成后侵入幾乎所有組織器官，但主要浸潤到關節滑膜內，并和基質結合到一起，來進一步發揮免疫抑制效應。IL－l主要是由多種細胞產生，比如:星狀細胞、成纖維細胞、樹突狀細胞及T、B細胞等。此外幾乎所有的有核細胞，均可產生IL－1。IL－1的家族至少有3個成員，即2個炎癥性激動劑IL－1α、IL－1β與l個抑制前兩者的受體性拮抗劑IL－1Ra。在人類IL－1β是起主要作用的，IL－1β主要由細胞釋放出來，它能分泌到細胞膜的外面，主要是通過作用于其它細胞而發揮其生物學效應。IL－1誘導的生物學效應的機制有:(1)對基因表達的影響有，IL－1對不同的基因表達行使其起始轉錄或穩定mRNA的功能，是IL－1具有不同生物學特性的基礎。(2)對受體表達的影響有，IL－1可以與靶細胞上的特異性受體結合后，才能充分發揮其生物學效應，經過細胞內部的信息傳遞，來抑制一些基因的表達。(3)協同作用有，IL－1與緩激肽等其它細胞因子以及生長因子都有協同作用。IL－6亦有廣泛的生物學活性，尤其是在機體免疫反應中具有重要的作用。IL－6可以具有強有力的誘導多克隆性B細胞分泌Ig M、Ig G與Ig A，也是T細胞產生細胞因子受體的化學誘導劑。L－6由于對T淋巴細胞兼有有趨化和活化兩方面的作用，因而在關節液中，IL－6可能促進 T細胞向炎癥性關節腔聚集并促使其活化。IL－6還可以對中性粒細胞與單核巨噬細胞的活性具有調控作用，并能刺激TNF－α、IL－1β、IL－15、IL－8、MCP－1和 IL－17等細胞因子的生成，大大加強了血管內皮與白細胞之間的黏附作用，這些都有助于淋巴細胞聚集于炎癥局部周圍，擴大炎癥反應過程。L－6還能促使B淋巴細胞增殖，促進 NK細胞分泌細胞因子與增加粘附分子的分布的轉變，最終影響T淋巴細胞對組織的浸潤、遷移。

本研究膠原性關節炎大鼠血清IL－1β、IL－6表達水平在造模組中有明顯升高，揭示二者在大鼠關節炎形成中扮演積極重要的角色，而TGF－β在模型組表現為降低，表明其有限制淋巴細胞因子活性，阻礙細胞因子的產生作用。治療兩周后，血清中IL－1β、IL－6水平有明顯下降，相應的TGF－β因子水平顯著升高。這些都說明丹參川穹嗪注射液明顯的調節免疫平衡，抑制炎癥產生的作用。也表明了其對膠原誘導性關節炎模型大鼠有明顯的積極治療作用，也為此復方制劑在臨床中的合理運用提供一定的參考價值意義。另外，其具體的機制作用，尚不能完全明了。有待進一步深入研究。

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