齊墩果酸對白血病HL－60細胞PI3K、Akt、Cav－1表達的影響

王迪迪，馬 微，葛堂棟，王明富，張鵬霞

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007;2.牡丹江醫院，黑龍江牡丹江157011)

白血病的治療一直以化療和骨髓移植為主，雖然近30年來急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的治療的取得了長足的進步，但仍然有20%以上的患者難以達到完全緩解，而且大多數完全緩解的患者最終還會復發和死亡。因此，更深入的探索AML發病的分子機制和治療靶點是當前學者們關注的焦點。現階段，抗腫瘤藥物的研發趨勢已經開始從傳統的細胞毒藥物轉向針對細胞內異常信號轉導的藥物。目前研究表明，在慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中均可檢測到PI3K/Akt信號通路的異常活化[1]。本課題旨在探討

齊墩果酸(oleanic acid，OA)對白血病HL－60細胞PI3K、Akt和Cav－1的mRNA表達以及細胞形態的影響，進一步明確OA治療白血病的靶點，為抗白血病天然藥物的開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

①主要試劑:RPMI－1640培養基購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青生物科技有限公司;齊墩果酸標準品購自中國藥品生物制品檢定所;RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、RT－PCR試劑盒及DL2000 Marker購自TaKaRa公司，MTT試劑盒購自Sigma公司，其余試劑為國產分析純。引物由TaKaRa公司合成，序列見表1。

表1 各引物序列

②藥品的配制:稱取36.5386mg的OA標準品(購自中國藥品生物制品檢定所)，溶于1.0mL的DMSO中，制成800μmol/L的貯存液備用。

1.2 方法

①細胞培養及分組:急性早幼粒細胞白血病系HL－60細胞株購自中科院上海生命科學研究院。用含10%胎牛血清RPMI－1640培養基，37℃，5%CO2培養箱中常規培養，每2～3天傳代一次。細胞分為加入DMSO的陰性對照組和經80μmol/L OA處理HL－60細胞48 h的OA組。

②細胞的形態學觀察:經4%戊二醛前固定，清洗后用1%餓酸后固定，常規脫水、浸透、環氧樹脂包埋制成樹脂塊，用LKBV型超薄切片機切片，鈾鉛雙染，作透射電鏡觀察。

③RT－PCR檢測PI3K、Akt的mRNA表達:按試劑盒說明書操作。

④Westem blot檢測CAV－1蛋白水平:制備HL－60細胞蛋白樣品后采用BCA法檢測蛋白濃度(按試劑說明操作)，檢測蛋白表達[1]。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，實驗所得數據以±s表示，組間比較采用q檢驗，指標之間的關系采用相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 透射電鏡觀察

電鏡下活細胞計數，OA組與對照組活細胞數相比明顯減少(比值為0.3754±0.0913，P ＜ 0.01)，平均抑制率為62.46%。電鏡觀察空白對照組細胞核完整且核質比例增大、核染色質分布均勻、細胞器結構完整;OA組呈現細胞間連接消失、核固縮且異形性明顯、核染色質邊集形成新月狀貼近核膜、內質網擴張呈空泡化、線粒體嵴模糊或消失、有凋亡小體形成。見圖1。

圖1 透射電鏡觀察OA作用后HL－60細胞的形態(×8000)

2.2 OA對HL－60細胞PI3K、Akt、Cav－1 mRNA表達的影響

2.2.1 OA對HL－60細胞PI3K mRNA表達的影響

OA處理組PI3K mRNA表達的相對強度為(0.5805±0.0191)，顯著低于陰性對照組(0.8615±0.0162)，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 OA對HL－60細胞PI3K、Akt、Cav－1mRNA表達的影響(±s)

表1 OA對HL－60細胞PI3K、Akt、Cav－1mRNA表達的影響(±s)

組 別 PI3K/β －actin Akt/β －actin Cav－1/β －actin OA 0.5805±0.0191 0.6789±0.0282 0.7583±0.0112 DMSO 0.8615±0.0162 0.8832±0.0135 0.5701±0.0163

2.2.2 OA對HL－60細胞Akt基因表達的影響

OA處理組Akt mRNA表達的相對強度為(0.6789±0.0282)，顯著低于陰性對照組(0.8832±0.0135)，有統計學意義(P ＜0.05)，見表1。

3 討論

白血病是一種嚴重危害人類健康的造血系統惡性腫瘤[2]，其病因和發病機制與多種遺傳學改變密切相關。細胞增殖或凋亡信號轉導通路中的某一環節異常，可使細胞增殖調節失控和/或對凋亡發生抵抗而引起細胞生長失控，最終導致腫瘤形成[3]。PI3K/AKT信號通路激活可抑制多種刺激引發的細胞凋亡、促進細胞周期進展、促進細胞生存和增殖、參與血管形成和腫瘤的轉移，在惡性腫瘤演變過程中扮演著重要角色。在細胞靜息狀態下，PI3K普遍存在胞漿中，具有酪氨酸蛋白活性的膜受體(如EGFR)和非受體型蛋白激酶(如Src)可激活Ⅰ型PI3K。生長因子與相應的酪氨酸激酶受體結合后，激活PI3K的催化亞基p110α，后者能催化PIP2肌糖環上D3位點，轉化為第二信使PIP3。PIP3形成“錨”結構可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結合，轉位到細胞膜。因此，PIP3能與AKT的PH結構域結合，引起胞漿中AKT向細胞膜轉位，繼而被細胞膜上的PI3K依賴性激酶1(PDK1)磷酸化其催化區的蘇氨酸308位點，而另一個未知的PI3K依賴激酶2(PDK2)則使絲氨酸473位點磷酸化，這兩個位點同時磷酸化是AKT激活的必要條件[4]。AKT是PI3K信號轉導途徑中一個重要的下游靶激酶，其下游有眾多的靶分子，激活的AKT從細胞膜脫離，進入細胞漿或細胞核內，激活或抑制下游靶蛋白，在轉錄和翻譯兩個水平同時對其靶基因的表達進行調節，從而在生理條件下產生抗凋亡、促增殖的活性[5，6]。Xu 等[7]研究發現，AML 細胞與正常細胞相比，存在著AKT激酶持續活化，經過PI3K抑制劑處理后其生存率降低明顯。Kubota等[8]實驗證明，半數以上AML患者標本存在PI3K的持續性活化。一方面，PI3K/AKT通路中信號轉導分子的活性異常可使下游凋亡通路受阻、加快細胞周期進程，促進正常細胞向腫瘤細胞轉化[9];另一方面 PI3K/AKT通路可能會因為受到上游各種受體－配體結合效應的調控和某些信號分子活性的影響，異常激活PI3K/AKT通路，而促進正常細胞向腫瘤細胞轉化[10]。研究表明，AKT的活化與白血病的發生發展密切相關[11]。前期實驗研究發現，80μM OA 作用 HL－60細胞48h抑制效果最佳[12～14]。此次研究以80μM OA作用HL－60細胞48h后發現HL－60細胞的PI3K、Akt和Cav－1 mRNA表達降低，形態學觀察發現OA作用后的HL－60細胞出現細胞凋亡現象，細胞抑制率增加，提示OA可能通過抑制PI3K/AKT信號通路轉導促進HL－60細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞增殖。

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