美洲大蠊提取物的質量標準研究

張臻，宋芹，胡慧玲，何瑤，傅超美

現代研究表明，美洲大蠊具有組織修復、改善微循環、清除自由基、消腫、促血管增生、抗炎鎮痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤及增強免疫等眾多功效。尤其是蛋白質和氨基酸含量高于50%以上，具有很好的護膚功效，因此逐漸成為國際上近年來比較流行的美容用品原材料和日化原材料。本課題所用美洲大蠊提取物是由美洲大蠊藥材粗粉以水為溶媒經閃式提取、除雜、冷凍干燥后所得實驗室自制粉末，課題組前期研究驗證表明美洲大蠊提取物的制備工藝穩定可行[1]。在工藝確定的基礎上，為了確保以其為原料開發的美容制劑療效可靠，課題組主要選取了與護膚功能相關的蛋白質、氨基酸、水分為指標控制其質量[2~3]。

1 試驗儀器與材料

1.1 儀器

UV1100紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；Mili-Q超純水處理儀（美國密理博公司）；恒溫干燥箱（上海森杏實驗有限公司，DGG-9240）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司,DZKW-4）；DL-360超聲波清洗器；高速臺式離心機（TGL-16G）；96孔酶標板（NUNC MaxiSorp）。

1.2 材料

美洲大蠊藥材提取物（實驗室自制）；谷氨酸對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：G-025-110305）；茚三酮（天津市瑞金特化學品有限公司，批號：110518）；PBS（pH7.2～7.4，）(北京中金橋生物技術有限公司)、氯化亞錫、硅膠G均為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取提取物0.12 g，加水10 mL攪拌使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對照藥材溶液的制備 取美洲大蠊對照藥材粉末1 g，加水10 mL研磨使溶解，濾過，濾液作為對照藥材溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取10 mL水，同供試品與對照藥材溶液制備方法研磨，濾過，濾液作為陰性對照溶液。

2.1.4 薄層色譜試驗 照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部 附錄ⅥB)試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(19：5：5)為展開劑，展開，取出。晾干，噴以0.5%茚三酮溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

供試品色譜中，在與對照色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，而陰性對照溶液在此相應位置上無對應斑點。結果見圖1。

圖1 美洲大蠊藥材提取物TLC鑒別圖

2.2 水分檢查

照《中國藥典》2010年版一部附錄IX H項下水分測定第一法進行測定。取美洲大蠊藥材提取物3 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在100～105 ℃干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時，冷卻，稱重，至連續兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據減失的重量，計算供試品中含水量。

三批樣品水分檢查結果見表1。結果表明，美洲大蠊藥材提取物的平均含水量為4.67%。將美洲大蠊藥材提取物的含水量標準按150%降低，故規定水分不得過7.0%。

表1 美洲大蠊藥材提取物水分考察結果(n=3)

2.3 含量測定 [4~7]

根據參考文獻與預實驗，選用紫外可見分光光度法來測定本品中總氨基酸的含量。

2.3.1 測定方法 對照品溶液的制備：取谷氨酸對照品適量，精密稱定，加PBS液（pH=7.2～7.4）配制成1 mg﹒mL-1的對照品母液[8]。

供試品溶液的制備：取美洲大蠊藥材提取物12 g，精密稱定，加純水定容至1000 mL，配成每1 mL含25 mg原生藥量的溶液。量取該溶液0.3 mL，置于25 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4）, 0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后加純水定容，即得。

測定法：對照品和供試品溶液均在570 nm處測定吸光度。供試品可通過標準曲線算出谷氨酸的含量（mg），并按以下公式由測定的谷氨酸含量計算樣品總氨基酸含量：

(W-氨基酸總量，% ；C-根據標準曲線查得的谷氨酸量，mg；L1-測定用試樣量，mL；L2-試液總量，mL；M-試樣質量，g；m-試樣干物率，%)。

2.3.2 線性關系考察 取谷氨酸對照品母液，稀釋10倍作為工作溶液，再取工作溶液2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 mL于一組25 mL容量瓶中，依次各加1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4），0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加純水定容，放置10分鐘后，以不同濃度標準品的吸光度對應濃度繪制標準曲線。結果：得到一元線性方程Y=21.467X+0.1399，r2=0.9981，在0.008～0.022 mg﹒mL-1范圍內呈良好線性關系。

2.3.3 精密度試驗 精密量取谷氨酸對照品工作溶液3.0 mL于25 mL容量瓶中，加1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4），0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后加純水定容，一天內連續測定6次吸光度。結果：RSD＜2%，儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密量取樣品溶液0.3 mL于25 mL容量瓶中，依次加入1.0 mL PBS液（pH=7.2～7.4），0.5 mL 2%的茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15分鐘，冷卻后加純水定容，分別于0，1，2，4，8 h后測定吸光度，結果：RSD＜2%，穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取美洲大蠊藥材提取物6份，按“2.3.1”進行供試品制備和測定，計算總氨基酸的含量。結果：RSD=2.2%，該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量M的藥材提取物5份，分別精密加入對照品適量，按“2.3.1”項下方法制備加樣回收率樣品，加樣回收率的結果見表1。平均回收率為99.3%，RSD值為2.11%。

表1 加樣回收率試驗結果

2.3.7 樣品測定 取三批美洲大蠊藥材提取物，按“2.3.1”項下進行供試品制備和測定，計算總氨基酸的含量。三批樣品測定結果見表2。

結果表明，谷氨酸含量均值為0.061%，氨基酸含量的均值為8.79%。綜合考慮藥材來源、制劑生產及貯存等因素，將美洲大蠊藥材水提物總氨基酸的含量標準略為降低，暫定本品谷氨酸含量不得少于0.049%，總氨基酸含量不得少于7.03%。

表2 美洲大蠊藥材提取物總氨基酸含量測定結果（n=3）

3 討論

本論文研究美洲大蠊提取物的質量控制標準，相比植物藥，動物藥的化學成分更為復雜，主要成分多是蛋白質與氨基酸。該藥材的蛋白質與氨基酸含量高于50%以上，且兩種物質具有組織修復、改善微循環、清除自由基等功效，符合課題組以其為原料開發美容制劑的需要。因此，課題組采用氨基酸和蛋白質為質控指標，以UV控制氨基酸含量，以TLC作為蛋白質指標質控的方法，同時，因為該水提物易吸潮，因此對其水分進行控制。質量標準中暫定本品水分不得超過8.0%，總氨基酸含量不得少于7.03%。所制定的質量控制方法簡便易行，選取的質量控制指標合理，能保證提取物的質量穩定可控。

[1] 張臻.M乳膏的藥學研究[D].成都:成都中醫藥大學,2012.

[2] 董玉秀,李中心,趙君玫.偏復康膠囊質量標準的實驗研究[J].河南中醫學院學報,2003,7(4):26.

[3] 邊海疆.莪術殘油軟膏劑的制備工藝及質量標準研究[D].遼寧:遼寧中醫藥大學,2010.

[4] 夏明,麻辰韶.紅花籽粕水溶性蛋白的提取與氨基酸組成分析[J].農產品加工,2009,(9): 41.

[5] 范婉萍,吳婕.用分光光度法測定含氮基酸類制品中的氨基酸含量[J].中國測試技術,2007,33(3):117.

[6] 章麗,劉松雁.氨基酸測定方法的研究進展[J].河北化工,2009,32(5): 27.

[7] 吳月娜,黃松,劉梅,等.青天葵中總游離氨基酸的提取工藝研究[J].中國中醫藥信息雜志,2011,(18)1:53.

[8] 周國蘭,何萍,鄭文莉.茚三酮比色法測定茶葉中游離氨基酸總量方法存在問題的探討[J].化學分析計量,2009,(18)5: 79.