滋陰活血利咽顆粒質量標準研究

趙萱，傅超美，徐曉秋，游宇

滋陰活血利咽顆粒是由丹參、玄參、麥冬、黃連、牛蒡子、余甘子、桔梗、蟬蛻等中藥組成的復方制劑，具有滋陰潤燥、活血化瘀、解毒利咽的功效，用于治療陰虛血瘀、邪毒滯留所致咽喉干燥、咽痛不適、咽內異物感的慢性咽炎[1]。為保證該藥的用藥質量，本試驗采用高效液相色譜法測定制劑中丹參素鈉的含量并進行了方法學驗證，采用薄層色譜法對制劑中丹參、赤芍、黃連、牛蒡子及玄參進行了鑒別，所建立的方法簡便、可靠、重復性好，可用于該制劑的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DiamonsilTM C18色譜柱（150×4.6 mm,5μm,美國迪馬公司）；Sartorius-BS110S分析天平（德國賽多利斯公司）；AS10200A超聲波清洗器（南京昕航科學儀器有限公司）；

丹參素鈉對照品（批號：810-200004）、芍藥苷對照品（批號0715-200211）、鹽酸小檗堿對照品(批號:110713-200208）、丹參對照藥材(批號： 0766-200417)、黃連對照藥材 ( 批號: 120913-200407)、牛蒡子對照藥材（批號： 0819 - 9802 )、玄參對照藥材（批號：121008-200505），均購于四川省藥品檢驗所，中國藥品生物制品檢驗所提供。糊精、蛋白糖為藥用規格。甲醇為色譜純試劑，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹參的薄層鑒別 稱取顆粒10 g，研細，加水50 mL，加鹽酸調節pH值至1，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次加入25 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；稱取丹參對照藥材2 g，加水200 mL，煎煮1.5小時，濾過，濾液濃縮至40mL，放冷，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次加入25 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液；取丹參素鈉對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液；稱取10 g陰性顆粒按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述四種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，用甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2:3:4:0.5:2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性無干擾。見圖1。

圖1 .丹參的薄層鑒別

2.1.2 赤芍的薄層鑒別 稱取顆粒10 g，加入飽和正丁醇20 mL振搖提取，正丁醇溶液加氨試液洗滌2次，每次加入10 mL，棄去氨試液，將正丁醇溶液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；稱取赤芍對照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，振搖5分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加2 mL乙醇使溶解，作為對照藥材溶液；取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，做為對照品溶液；稱取10 g陰性顆粒按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-冰醋酸-水(15:0.5:1:1:2)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性無干擾。見圖2。

圖2 赤芍的薄層鑒別

2.1.3 黃連的薄層鑒別 稱取顆粒5 g，加甲醇25 mL，超聲處理25 min，濾過，取濾液作為供試品溶液；黃連對照藥材0.25 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為對照藥材溶液；取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液；稱取5 g陰性顆粒，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，用苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（4:2:1:1:0.2）展開[3]，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同的黃色熒光斑點，且陰性無干擾，見圖3。

圖3 黃連的薄層鑒別

2.1.4 牛蒡子的薄層鑒別 取本品顆粒10 g，加水20 mL溶解，加鹽酸3 mL，置水浴中加熱回流1小時，用三氯甲烷萃取兩次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，水浴揮干，殘渣加乙酸乙酯30 mL，活性炭1 g，加熱煮沸，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液；取牛蒡子對照藥材粉末0.5 g，加水30 mL，煎煮1小時，冷卻，濾過，加鹽酸3 mL，置水浴中加熱回流1小時，用三氯甲烷萃取兩次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，水浴揮干，殘渣加乙酸乙酯30 mL，活性炭1 g，加熱煮沸，濾過，濾液濃縮至2 mL，作為對照藥材溶液；稱取10g陰性顆粒，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，用環己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(5:5:0.2)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同斑點，且陰性無干擾，見圖4。

圖4 牛蒡子的薄層鑒別

2.1.5 玄參的薄層鑒別 取本品顆粒10 g，加甲醇25 mL，浸泡1小時，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加2 mL甲醇使溶解，作為供試品；取玄參對照藥材粉末2 g，加甲醇25 mL，浸泡1小時，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加2 mL甲醇使溶解，作為對照藥材溶液；稱取10 g陰性顆粒，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述四種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-甲醇(5:1)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同斑點，且陰性無干擾，見圖5。

圖5 玄參的薄層鑒別

2.2 丹參素鈉的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilTM C18色譜柱（150×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL﹒min-1；靈敏度：0.05 AUFS；檢測波長：281 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對照品適量，加甲醇制成每1 mL含丹參素鈉 0.1161 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量顆粒，研細，置100 mL具塞錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，超聲提取40分鐘，放冷，稱定重量，以60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備 精密稱取缺丹參的陰性顆粒按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.5 線性范圍的考察 精密吸取濃度為0.1161 mg﹒mL-1的丹參素鈉對照品2，4，6，8，10，15，20 μL，依次進樣。測定峰面積值，并以峰面積值（A）對進樣量C（μg）線性回歸，得回歸方程為：A = 529980C + 4789.6 （r=0.9997）。試驗結果表明，丹參素鈉在0.2322 ~2.322 μg范圍內峰面積值與進樣量有良好線性關系。

2.2.6 專屬性考察 精密吸取丹參素鈉對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10 μL，依次進樣，測定得丹參素鈉對照品、供試品均出現丹參素鈉特征峰，而陰性溶液無該特征峰。供試品中丹參素鈉與其它組分可達基線分離，保留時間適當，與鄰近色譜峰的分離度R>1.5，按丹參素鈉峰計算理論塔板數n>3000。結果表明，在選定條件下處方中其他成分對丹參素鈉的含量測定無干擾。所得圖譜見圖6、圖7、圖8。

圖6 丹參素鈉對照品溶液的HPLC圖譜

圖7 供試品溶液的HPLC圖譜

圖8 陰性溶液的HPLC圖譜

2.2.7 精密度考察 精密吸取丹參素鈉對照品溶液10μL，連續進樣6次，測定峰面積值并計算丹參素鈉的含量，計算丹參素鈉峰面積的RSD為0.26%，結果表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性考察 按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法，取同一藥液6份制備供試品溶液，分別進樣10 μL，測定峰面積值并計算丹參素鈉的含量。丹參素鈉的含量的RSD為1.47%，結果表明方法重現性良好。

2.2.9 穩定性實驗考察 精密吸取同一供試品溶液和丹參素鈉對照品溶液，于0，2，4，6，8，10，12，24 h分別進樣10 μL，并測定不同時間點的峰面積。結果表明，對照品溶液峰面積的RSD為1.20%，供試品溶液峰面積的RSD值為1.16%。供試溶液和對照品溶液在24小時內較為穩定，可滿足測定需要。

2.2.10 加樣回收率實驗考察 精密吸取已知含量的供試品溶液（丹參素鈉含量為1.54 mg﹒g-1)適量，共計9份，置25 mL容量瓶中，分別加入丹參素鈉對照品溶液（0.1132mg﹒mL-1）1，1，1，2，2，2，3，3，3 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品試液，測定峰面積并計算回收率，試驗結果見表1。

表1 加樣回收率測定結果

結果表明，加樣回收率在95%～105%之間，平均回收率為97.08%，符合含量測定的要求。

2.2.11 樣品的含量測定 取三批樣品，按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液。精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積值，計算丹參素鈉的含量，結果見表2。由以上測定結果可知，3批樣品含量的均值為

表2 樣品中丹參素鈉含量測定結果

1.535 mg﹒g-1，考慮到藥材的來源、炮制加工、制劑生產及貯存等因素，含量限度在三批均值的基礎上下降20%，故暫定本品每克含丹參素鈉不得少于

1.228 mg。

3 討論

3.1 滋陰活血利咽顆粒源自于長期運用于臨床治療慢性咽炎的經驗方——滋陰活血利咽湯，該方以湯劑形式運用于臨床多年，療效顯著。研制滋陰活血利咽顆粒，既體現了傳統湯劑療效好、見效快的特色，又有服用劑量小、貯存、攜帶方便等優點。慢性咽炎的患者多伴有咽部發干、異物感或輕度疼痛等癥狀，本品較之于片劑、膠囊劑等其他固體劑型，更利于患者服用。

3.2 在鑒別中，分別以丹參素鈉對照品、丹參對照藥材、芍藥苷對照品、赤芍對照藥材、鹽酸小檗堿對照品、黃連對照藥材、牛蒡子對照藥材、玄參對照藥材為對照，對方中丹參、赤芍、黃連、牛蒡子、玄參進行了薄層色譜鑒別。在對黃連進行薄層鑒別中，預實驗中出現拖尾現象，后經分析，或因黃連有效成分為生物堿，因此在展開時適當熏以氨蒸氣以克服拖尾現象；在對牛蒡子進行薄層鑒別中，預實驗中先采用常規方法以乙醇為提取溶劑制備牛蒡子對照藥材溶液，而所得薄層色譜上斑點偏多，主斑點Rf值偏高，難以與樣品對應，多次試驗之后，將牛蒡子藥材加鹽酸溶解，而后噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色，鑒別其酚性成分，色譜圖上顯一個主斑點，特征性強。

3.3 含量測定中，丹參素鈉是處方中君藥丹參的主要水溶性有效成分，其含量的高低對制劑臨床療效影響較大，因此，選擇丹參素鈉含量作為含量測定指標。

[1] 彭順林,鐘渠.滋陰活血利咽湯治療慢性咽炎47例療效觀察[J].甘肅中醫,1998,11(6):14.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:70.

[3] 韋松基,王志萍,曹宇,等.壯藥依肝達顆粒質量標準研究[J].時珍國醫國藥,2011, 22(11):2674.