CD105與Ezrin蛋白在結直腸癌中的表達及臨床意義

李宏偉，王鐵山，熊正文，李 偉，黃 勇，胡海霞

近年來，隨著人們生活水平提高和飲食習慣的改變，消化道腫瘤的發病率逐年增加。CD105是一種內皮細胞增殖標志物，在與腫瘤有關的新生血管內皮細胞中高度表達，是目前衡量內皮增殖狀態比較準確的指標。Ezrin是影響黏附功能和腫瘤細胞惡性演進過程中的重要物質。Ezrin蛋白和腫瘤新生血管是近來臨床研究熱點，但其與結直腸癌的關系目前并不清楚。本研究依據光波/微波(Lightwave/Microwave，LW/MW)輻射熱效應的原理，應用免疫組化 LW/MW-EnVisionTM法檢測 CD105和Ezrin蛋白在結直腸癌組織中的表達，并對其與結直腸癌患者臨床病理特征關系進行了分析，以期為判斷結直腸癌的生物學行為和患者預后提供客觀參考指標。

1 材料與方法

1.1 材料 收集解放軍251醫院病理科2006年12月—2010年12月手術切除結直腸癌標本100例，術前均未行放化療。其中男57例，女43例;高/中分化腺癌73例，低分化腺癌27例;腫瘤未及漿膜層36例，浸潤漿膜層64例;無淋巴結轉移44例，有淋巴結轉移56例。并取同期正常黏膜組織30例(遠離癌組織4 cm以上)、腺瘤組織30例。所有標本按照常規石蠟切片、染色規范步驟操作。

1.2 試劑與主要儀器 鼠抗人CD105、Ezrin單克隆抗體、DAB顯色液為福州邁新生物有限公司提供(均為即用型);EnVisionTM試劑盒為福州邁新生物有限公司提供。格蘭仕WD900G LW/MW爐。額定輸入功率:MW為1400 W，LW為1050 W;額定微波輸出頻率為2450 MHz;微波輸出功率為900 W，分為微波、光波、光波/微波組合Ⅰ和光波/微波組合Ⅱ4種輸出功能。

1.3 免疫組化染色方法 采用LW/MW-EnVisionTM法，微波輸出功率分為5檔調節，光波輸出為單一光波管發光，采用LW/MW組合Ⅱ方法，參照文獻［1］及試劑說明書操作。步驟如下:①石蠟切片常規脫蠟入水，用LW/MW 5檔(輸出功率90 W，下同)，PBS(pH7．4)洗 2 min，2 次;②抗原修復［2-3］:用微波 －枸櫞酸鈉緩沖液(0．01 mol/L，pH 6．0)做抗原修復，先用LW/MW 3檔(輸出功率150 W)修復抗原2 min，再用LW/MW 5檔修復抗原5 min，2次，待自然冷卻至近室溫時自來水洗，PBS洗2 min，2次;③用LW/MW 5檔，在甲醇－過氧化氫溶液中封閉內源性過氧化物酶2 min，PBS洗2 min，2次;④加一抗，LW/MW 5檔5 min，PBS洗2 min，3次;⑤加聚合物增強劑，室溫下孵育20 min，PBS洗2 min，3次;⑥加生物素化的羊抗兔IgG(1∶300)，37℃、30 min，LW/MW 5 檔 5 min，PBS 洗 2 min，3次;⑦DAB-H2O2顯色10 min;自來水終止顯色;⑧蘇木素復染0．5～1 min(用于圖像分析的切片不作蘇木素復染);⑨常規脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定

1.4.1 CD105陽性:CD105陽性分布在血管內皮細胞胞質，呈陽性的血管多為新生薄壁、管徑小的血管，大的厚壁血管未見CD105的表達。微血管計數方法［2-4］:以CD105為血管標記物的微血管計數，首先在低倍鏡下(×40)掃描，尋找腫瘤內清楚的血管染色，且微血管密度(MVD)最高的區域(熱點)，然后在 ×200倍鏡(×20物鏡和 ×10目鏡，面積為0．739 mm2)下計數腫瘤內的毛細血管和小靜脈數目，腫瘤硬化區和鄰近正常結直腸組織內的微血管不作計數對象，只作內對照評價免疫組化染色。任何呈棕黃色的陽性內皮細胞或內皮細胞簇且與鄰近血管、腫瘤細胞和其他結締組織成分清楚分開即為一個能夠計數的微血管。肌層較厚及血管管腔面積＞8個紅細胞直徑的血管均不計數。因為計數微血管的方法在觀察者之間或觀察者本人存在差異，所以在不同的時間計數3次，選擇2次相同或相近數目的平均數。

1.4.2 Ezrin陽性判定:Ezrin陽性著色在腫瘤細胞膜和胞質內，陽性判定標準參考文獻［5］。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13．0軟件進行統計學處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗，α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 CD105標記的微血管計數結果 CD105表達于腫瘤組織內新生血管的內皮細胞胞質內，呈淺棕至深棕色(圖1、2)。100例結直腸癌標本中微血管計數為(36．18±8．27)條，結直腸正常黏膜組織中未見CD105表達，結直腸腺瘤組織中微血管計數為(27．73±6．13)條，3組差異有統計學意義(P ＜0．01)。CD105標記的微血管與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關(P＜0．05)，見表1。

圖1 結腸低分化腺癌新生及增生的微血管內皮CD105陽性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

圖2 直腸腺瘤血管內皮CD105陽性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

圖3 結腸低分化腺癌Ezrin蛋白陽性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

圖4 結腸絨毛狀腺瘤Ezrin蛋白陽性(LW/MW-EnVisionTM法×200)

2.2 Ezrin蛋白表達 Ezrin蛋白表達于腫瘤細胞胞膜和胞漿，呈淺棕至深棕色(圖3、4)。Ezrin蛋白在結直腸正常黏膜、結直腸腺瘤、結直腸癌組織表達陽性率分別是 23．3%(7/30)、50．0%(15/30)、72．0%(72/100)，三者表達陽性率依次增高，兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0．05)。Ezrin蛋白在100例結直腸癌組織中的陽性表達與浸潤深度、淋巴結轉移密切相關(P＜0．05);與其性別、年齡、分化程度、TNM分期無關(P＞0．05)，見表1。

表1 Ezrin、CD105蛋白表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

2.3 Ezrin與CD105蛋白表達在結直腸癌組織中的關系 Ezrin蛋白陽性表達的72例結直腸癌中CD105標記的微血管計數為(38．21±6．38)條，明顯高于Ezrin蛋白陰性表達的28例結直腸癌中CD105標記的MVD微血管計數為(34．74±8．59)條，兩者存在一定的關聯性(r=0．406，P＜0.01)。

3 討論

豐富的血管可向腫瘤提供豐富的營養成分，有利于生長;而腫瘤細胞侵入血管內，易導致在其他部位生長形成遠處轉移灶;腫瘤中新生血管數量越多，越能夠增加腫瘤的生長速度且發生轉移的可能性大增。因此，腫瘤組織中血管的定量已被認為是一重要的獨立的預后指標［6］。本研究結果顯示，CD105標記的微血管在結直腸正常黏膜、腺瘤及結直腸癌間差異有統計學意義，且與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期密切相關，與許多研究結果相似［7-10］。說明微血管在腫瘤的生長、浸潤過程中起重要作用，同時也直接或間接表明抗新生血管治療可抑制腫瘤的生長［11］。因此，檢測腫瘤的微血管不僅可以評估患者的預后情況，并且可以為臨床制定合理有效的腫瘤治療、控制方案提供理論依據。

Ezrin蛋白為膜細胞骨架連接蛋白［12］，對細胞形態、分化、運動性和細胞與細胞、細胞與間質黏附有重要調節作用，通過調節腫瘤細胞黏附分子和信號轉導等途徑，參與細胞與細胞、細胞與間質的相互作用，影響腫瘤的浸潤和轉移［13-14］。有研究發現Ezrin蛋白的高表達與腫瘤的侵襲和轉移有關［15-17］。而最近研究表明，存在持續活化狀態Ezrin的細胞都伴有E-cadherin在細胞內的聚集，導致細胞連接的破壞，降低細胞間的黏附，使腫瘤細胞易于浸潤轉移。本研究發現，Ezrin蛋白在結直腸癌組織中的表達顯著高于結直腸正常黏膜和結直腸腺瘤，且腺瘤與正常黏膜之間也存在顯著差異，說明其可能在結直腸癌的發生、發展中也起著重要的促進作用，但具體機制有待進一步研究。同時Ezrin蛋白表達與結直腸癌浸潤深度、淋巴結轉移密切相關。這與一部分學者的研究結果相似［18-19］。Ezrin蛋白可能通過調節細胞黏附、腫瘤細胞信號轉導等進而參與腫瘤浸潤轉移［20-22］。

在本實驗中，通過結直腸癌中Ezrin蛋白的表達與CD105標記的微血管之間的關系發現，Ezrin蛋白表達陽性的結直腸癌中CD105標記的微血管計數明顯高于陰性表達的結直腸癌組織。提示二者之間存在一定的關聯性，Ezrin蛋白高表達可能促進腫瘤微血管的生成，但其機制尚不十分清楚。有研究認為這可能與Ezrin蛋白的高表達使膜上的轉移相關信號通過與Rho蛋白相關的信號通路得到放大有關，后者可通過蛋白激酶信號轉導通路促進腫瘤血管的生成，進而協助腫瘤細胞穿越脈管內皮向遠處轉移［23］。

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